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       【摘要】 
       目的研究五鹤续断中总生物碱的提取分离工艺。方法采用单因素实验和正交实验，研究索氏提取续断总生物碱的工艺条件，并用紫外分光法测定总生物碱的含量。结果得出五鹤续断总生物碱的最佳提取工艺条件。结论当料液比为1∶20，提取时间为10 h，酸度值为3～3.5时，五鹤续断总生物碱提取率最高。
       【关键词】  五鹤续断 总生物碱 单因素实验 正交实验 提取 分离
       Studied on Procedure Optimization of the Extraction of the Total Alkaloids in WuHe Dipsalus asper
       WU Yun
       (Hubei Iinstitute for Nationalities, Key Laboratory of Biological Resources Protection and Utilization of Heibei Province, Enshi 445000, China)
       Abstract：ObjectiveThis article studied the separation procedure on extraction of total alkaloids.MethodsThrough orthogonal experiment, the effect of the ration of solid-liquid,PH and time on extraction of total alkaloids were obtained, the contents of total alkaloids were determined by Arthrone coloimetry.ResultsProcedure Optimization of the extraction of the total alkaloids in Wu-He Dipsaus asper was obtained.Conclusion The optimization separation procedures were as follows; the ration between material and solvent is 1∶20, the time is 10h, the PH is 3～3.5.
       Key words：Wu-He Dipsacus asper;  Total alkaloids;  Extraction；  Separation procedure；  Orthogonal experiment
       五鹤续断Dipsacus asper属于川续断科植物，多年生草本，药用部位为其干燥根［1］。五鹤续断经过加工后具有根条粗，无头尾，质柔软，墨绿色（俗称乌梅色）菊花心，气微，味微苦，微甜而涩的品质特色，尤其是“乌梅花心”的特征享誉国内外［2］。五鹤续断的有效成分主要有皂苷、挥发油类、生物碱类、维生素E和蔗糖等，临床上主要用于治疗腰膝酸软、跌打损伤、骨折［3］、腰椎骨质增生、先兆性流产和习惯性流产［4］等症状，它具有补肝益肾、续接筋骨、抗骨质疏松、止血安胎等功效［5］。
       
       生物碱是一类天然含氮有机化合物，是存在于中药中的重要化学成分。五鹤续断中的总生物碱，在临床上可用来治疗先兆性流产和习惯性流产等症状，其作用机理主要为五鹤续断总生物碱能显著抑制子宫平滑肌的自发收缩活动，因此，研究五鹤续断总生物碱的提取分离工艺的工艺优化，既能提高其产品的科技含量，为进一步开展其药用及保健方面的应用开发奠定基础，又能合理开发中药资源，创造较高的经济效益和社会效益。
       1  器材与方法
       1.1  采样及样品预处理本研究所用材料均来自恩施州鹤峰县走马镇万寺坪道地药材五鹤续断GAP研究及种植基地，野生续断采自GAP基地周围的环境。采用随机取样的方法，分别取人工种植1年生、2年生、3年生和野生的新鲜植株各10株（其根生长3年以后木质化，不能药用），用无离子水将其根、茎、叶分别洗净，切碎后放在105℃的烘箱里杀青30 min～1 h后，于80℃下烘至恒重，将各样品用粉碎机打磨成粉末，过60目筛，装于试剂瓶中，贴上标签，置于干燥器内贮存备用。
       1.2  仪器及试剂
       1.2.1  仪器植物样品粉碎机，索氏提取器，756MC-紫外分光光度计，PHS-3C酸度计，SHZ-D循环水式真空泵，RE-52型旋转蒸发器，电热恒温干燥箱，电子天平（上海天平仪器厂），水浴锅，低速大容量多管离心机，双重蒸馏水器等。
       1.2.2  试剂咖啡因，溴甲酚绿，邻苯二甲酸氢钾，无水乙醇，氯仿，乙醚，盐酸，氨水等试剂均为分析纯，所用水为双蒸水。
       1.3  实验方法《中国药典》［6］记载总生物碱含量的测定采用氨水碱化后氯仿提取，本实验在此基础上进行了适当的改进。
       1.3.1  总生物碱的提取分离采用索氏提取法对五鹤续断中总生物碱进行提取并分离。步骤：准确称取五鹤续断干粉5 g装入索氏提取器中，用90%的无水乙醇100 ml进行提取。加热提取10 h后，将提取物用蒸馏水稀释到200 ml，然后用6 mol/L的盐酸溶液调节其pH值为3～3.5，搅拌均匀后，抽滤，再往所得滤液中加入体积分数为10%的氨水，并调节其pH值至8～9，用氯仿萃取两次，25 ml/次。将所得氯仿萃取液蒸馏后所得的黄色液体即为溶有生物碱的粗品。
       
       将生物碱粗品溶于200 ml蒸馏水中，用6 mol/L HCl溶液调节其pH值为3～3.5，然后用乙醚洗涤两次，10 ml/次，弃去乙醚层，然后在水层中用体积分数10%的氨水调节pH值为10左右。再用氯仿萃取2次，方法同上。所得氯仿液进行蒸馏即可得总生物碱精品，将其定溶为4 ml待测。
       1.3.2  总生物碱的测定选用咖啡因作为标准替代品，并制作标准曲线，采用紫外分光光度法进行总生物碱含量的测定。
       2  结果与分析
       2.1  单因素实验
       2.1.1  料液比对续断总生物碱提取的影响准确称取五鹤续断干粉5 g，分别用90%的无水乙醇50，75，100，125，150 ml进行索氏提取10 h，来研究料液比对续断总生物碱提取的影响。结果见表1。表1  料液比对续断总生物碱的影响（略）
       由表1可知，料液比是影响续断总生物碱浸出的主要因素之一。随着料液比的增加，总生物碱提取率也增加，但料液比达到1∶20以后生物碱提取率没有多大变化，从节约原料和提取效率等方面考虑，应选择料液比为1∶20左右为宜。
       2.1.2  提取时间对续断总生物碱的影响精密称取五鹤续断干样品5.0 g，用90%的无水乙醇100 ml进行索氏提取，研究提取时间对总生物碱提取率的影响。按照“1.3.1”的实验方法，将不同时间下提取所得到的总生物碱用紫外分光光度法测定。结果见表2。表2  提取时间对续断总生物碱的影响（略）
        分析表明，提取时间的长短与所得到的生物碱总量有很大的关系，索氏提取10 h时其吸光度最大，所得总生物碱量最多，提取效率最高，而10 h后随着提取时间的延长，总生物碱含量降低。因此，应选择提取时间为10 h最佳。
       2.1.3  pH值对续断总生物碱提取的影响称取续断干粉样品5.0 g，用90%的无水乙醇100 ml进行索氏提取10 h后，将提取物用蒸馏水稀释到200 ml，然后用6 mol/L的盐酸溶液调节其pH值分别为2.0，2.50，3.0，3.5，4.4等，来研究酸碱度对总生物碱提取率的影响。结果见表3。表3  不同酸度对续断总生物碱的影响（略）
       结果显示，采用紫外分光光度法测定总生物碱的过程中，酸度值对其测定结果也有影响，当pH值为3.03时其吸光度最大，因此，本实验应选择pH=3～3.5。
       2.2  确定五鹤续断中总生物碱提取的最佳工艺用人工种植的3年生五鹤续断根作为实验材料，以确定其最佳提取工艺。影响续断总生物碱提取率的因素很多，为综合分析各因素的影响程度，本实验采用3因素3水平正交试验L9（34），以确定续断总生物碱提取的最佳工艺条件。实验方案设计见表4。表4  影响续断总生物碱提取因素实验水平（略）
       根据因素水平表4，按正交实验L9（34）进行索氏提取后，将提取物用蒸馏水稀释到200 ml，然后用6 mol/L的盐酸溶液调节其pH值为3～3.5，搅拌均匀并抽滤。按照“1.3.1”项方法进行分离纯化后，用分光光度法进行含量测定。正交实验设计与实验结果见表5。经直观分析，初步筛选出续断总生物碱提取分离工艺的最佳水平组合为A2B2C2。
       2.3  不同生长期的五鹤续断总生物碱含量的分析
       用人工种植的不同生长时期五鹤续断根、野生根和续断茎、续断叶作为实验材料，精密称取其干样品各5.0 g，用90%的无水乙醇100 ml进行索氏提取10 h后，将提取物用蒸馏水稀释到200ml，然后用6mol/L的盐酸溶液调节其pH值分别为3.03，搅拌均匀并抽滤。按照“1.3.1”项方法进行分离纯化后，用分光光度法进行含量测定。结果见表6。表5  续断总生物碱提取分离的正交实验L9（34）结果（略）表6  五鹤续断不同生长时期总生物碱的含量（略）
       研究结果显示，在一定生长年限内，人工种植的不同生长年限的五鹤续断根中总生物碱含量的变化具有一定的规律性，即随着生长年限的增加，其根中总生物碱的含量积累呈现递增趋势。与其根相比较，五鹤续断茎、叶中总生物碱的含量要低得多，这也是五鹤续断药用部位为其根的主要原因之一，同时也说明五鹤续断在生长过程中所形成的总生物碱主要积累在根部，并且3年生根中总生物碱含量最高。
       3  讨论
       通过五鹤续断总生物碱提取分离的单因素实验和正交实验分析，确定了五鹤续断总生物碱提取分离的最佳工艺条件，即在料液比为1∶20，提取时间为10 h，提取后的酸度值为3～3.5时，五鹤续断总生物碱的提取率最高。
       五鹤续断在生长过程中所形成的总生物碱主要积累在根部，随着生长年限的增加，其根中总生物碱的含量积累呈现递增趋势。可见，用于临床中药材或用于提取五鹤续断总生物碱的原料以人工种植的3年生的五鹤续断根为最佳。
       【参考文献】
         　　［1］张万福.湖北“五鹤续断”的地道历史考证及开发前景［J］.湖北民族学院学报(医学报),2002,19(3):24.
       
       ［2］武 芸,丁 莉,周吉源.五鹤续断的研究概况与开发前景［J］.湖北民族学院学报(医学版),2004,21(4):31.
       
       ［3］纪顺心,吴雪琴,李崇芳.中药续断对大鼠实验性骨损伤愈合作用的观察［J］.中草药, 1997,28(2):98.
       
       ［4］龚晓健,季 晖,王 青,等.川续断总生物碱对妊娠大鼠子宫的抗致痉及抗流产作用［J］.中国药科大学学报,1997,29(6):459.
       
       ［5］全国中草药汇编写组. 全国中草药汇编（下册）［M］.北京:人民卫生出版社，2000,135.
       
       ［6］国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］.北京:化学工业出版社，2000:273.