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       【摘要】 
       目的研究超声辅助提取厚朴叶中厚朴酚及和厚朴酚的方法。方法采用正交实验进行提取方法的研究，用HPLC法测定厚朴酚及和厚朴酚的含量，流动相为甲醇-水-冰醋酸（85∶15∶0.25），流速为1.0 ml/min，检测波长为294 nm，柱温为23℃。结果用超声强度中等、酒精浓度100%、提取时间为24 h以及料液比1∶40的提取条件可很好地提取厚朴叶中的厚朴酚及和厚朴酚，和厚朴酚、厚朴酚以及总酚的提取率分别为92.15%，70.83%和85.27%；RP-HPLC方法较好，结果理想。结论研究得到了很好的超声辅助提取厚朴叶中厚朴酚及和厚朴酚的方法。
       【关键词】  厚朴酚 和厚朴酚 超声提取 反相高效液相色谱法
       A Study on the Ultrasonic Extraction for Magnolol and Honokiol in Leaves of Magnolia offcinalis Rend et Wils
       LIU Xiaopeng , JIANG Ning
       1. Hubei Key Laboratory of Biological Resource Conservation and Utilization, Hubei Institute for Nationalities, Enshi 445000,China; 2.School of Biological Science and Technology , Hubei Institute for Nationalities, Enshi 445000,China
       Abstract：ObjectiveTo develop an ultrasonic extracting method for Magnolol and Honokiol in leaves of Magnolia offcinalis Rend et Wils.Methods The extraction method was optimized by orthogonal experiment and the contents were determined by HPLC.Results100% ethanol, extracting 24 hours, ration of materials to liquid 1∶40 and middle intensity of ultrasonic was the optimal extracting method. The extracting rate of Magnolol was 92.15%. The extracting rate of Honokiol was 70.83%. The RP-HPLC for determining method was simple,rapid and accurate. Conclusion The ultrasonic extracting method is practicable for Magnolol and Honokiol in leaves of Magnolia offcinalis Rend et Wils.
       Key words：Magnolol；  Honokiol；  Ultrasonic extraction；  RP-HPLC
       中药材厚朴为木兰科植物厚朴Magnolia offcinalis Rend et Wils的干皮、根皮或枝皮，性温味苦辛，无毒，入脾、胃、大肠经，能温中下气，燥湿消痰。厚朴是一种极为重要的中药材。厚朴在我国已有两千多年药用历史，用于治疗多个系统和器官的疾病，我国很多民间验方如厚朴三物汤、平胃散、大承气汤、四七汤和栀子厚朴汤中都含有生药厚朴；2005版《中国药典》Ⅰ部中有包括藿香正气水、香砂养胃丸、开胸顺气丸、柴胡舒肝丸等二十多个常用中成药的主要原料药均含厚朴［1］。现代药理学研究表明,厚朴具有抗菌、抗病毒、抗过敏、影响胃肠活动、肌肉松弛和中枢抑制等作用［2］。
       厚朴为落叶乔木，是重要的林业资源，多年生，生长周期长，一般要十多年才能供剥皮药用；现今厚朴药材的来源是伐树剥皮，为掠夺式取材，不利于环境。厚朴叶含有厚朴的主要有效成分［3］，但厚朴叶是否可以替代厚朴皮入药，需要进一步研究。目前尚没有用超声法提取厚朴叶中厚朴酚以及和厚朴酚的报道。
       本研究利用正交实验，进行了超声法提取厚朴叶中厚朴酚及和厚朴酚的研究。报告如下。
       1  器材与方法
       1.1  材料与试剂
       厚朴叶取自湖北恩施市双河乡，为紫油厚朴的自然落叶。提取用无水乙醇、甲醇为分析纯，HPLC甲醇为色谱纯， 厚朴酚、和厚朴酚标准品由中国药品生物制品检定所提供。
       1.2   仪器
       JY96-Ⅱ超声波细胞粉碎机；美国DIONEX公司P680LPG型高效液相色谱仪；RE-52型旋转蒸发仪。
       1.3  方法
       1.3.1  厚朴叶中酚类物质的全提取取干燥的厚朴叶，粉碎，过60目筛，取适量用无水乙醇于索氏抽提器中提取至无色为止；用旋转蒸发仪浓缩后定容，取样用甲醇稀释10倍后进行HPLC测定含量，3次重复。
       1.3.2 厚朴叶中酚类物质的超声提取采用正交实验L9（34）进行超声提取厚朴叶中厚朴酚及和厚朴酚的研究，正交实验的因素水平表见表1。超声处理后，进行提取，提取过程中进行磁力搅拌，提取结束后过滤、3次淋洗、浓缩及定容取样，用甲醇稀释后进行HPLC测定含量。表1  因素水平（略）
       
       1.3.3  色谱条件色谱柱为Diamonsil（TM）C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相为甲醇-水(79∶21)，流速1.0 ml/min，检测波长294 nm，柱温23℃，进样量20 μl。
       1.3.4  线性范围考察精密称取厚朴酚、和厚朴酚对照品适量，加甲醇制成每毫升含厚朴酚标准品360，180，90，45，22.5，11.25，5.6 μg以及每毫升含和厚朴酚标准品440，220，110，55，27.5，13.75，6.875 μg的浓度梯度，分别吸取溶液20 μl ，注入HPLC仪测定。以对照品浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，进行线性回归。
       1.3.5  精密度实验取厚朴酚90 μg/ml以及和厚朴酚浓度为110 μg/ml的对照品溶液，重复进样6次，记录色谱峰面积，计算RSD。
       1.3.6  重复性实验取索氏提取的一个样品，依法平行测定5次，记录厚朴酚与和厚朴酚的色谱峰面积，计算RSD。
       1.3.7  稳定性实验取索氏提取的一个样品，每隔2 h进样1次，共进样5次，考察供试品溶液的稳定性。
       1.3.8  回收率实验取已测知含量的样品5份，分别精密加入对照品适量，依RP-HPLC法测定，计算回收率，RSD。
       2  结果
       2.1   HPLC结果及标准品线性关系在前述色谱条件下，厚朴酚与和厚朴酚与其他成分能够很好地分离(图1)；以对照品浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，进行线性回归。厚朴酚浓度在5.6～360 μg/ml，和厚朴酚浓度在6.875～440 μg/ml范围内与峰面积线性关系良好。回归方程为：厚朴酚Y=0.634 724X-3.027 91，R=0.997 75；和厚朴酚Y=0.579 992X-5.028 17，R=0.996 795。
       2.2  超声提取正交实验结果
       各因素对和厚朴酚提取的重要性为A＞C＞B＞D, 对厚朴酚提取的重要性为C＞D＞A＞B, 对总酚提取的重要性为C＞A＞B＞D；综合考虑，超声提取最优方法为：超声强度中等，酒精度100%，提取时间为24 h，料液比1∶40。2.3  优选提取方法的验证采用上述最优方法提取3次，和厚朴酚、厚朴酚以及总酚的提取率分别平均为92.15%，70.83%和85.27%，表明本方法的提取效果较好。
       2.4  精密度实验结果 
       取厚朴酚以及和厚朴酚浓度为100 μg/ml的对照品溶液，重复进样6次，记录色谱峰面积，计算得厚朴酚与和厚朴酚的RSD分别为1.24%，1.47%。
       2.5  重复性实验 
       取索氏提取的一个样品，依法平行测定5次，记录厚朴酚与和厚朴酚的色谱峰面积，计算得厚朴酚与和厚朴酚的RSD分别为1.05%，1.33% 。
       2.6  稳定性实验
       取索氏提取的一个样品，每隔2 h进样1次，共进样5次，结果供试品溶液在10 h内稳定，厚朴酚与和厚朴酚的RSD分别为1.31%，1.81%。
       2.7  回收率实验 
       取已测知含量的样品5份，分别精密加入对照品适量，依RP-HPLC法测定，结果见表3，表4，和厚朴酚的平均回收率为97.89%，RSD为0.83%；厚朴酚的平均回收率为97.58%，RSD为1.2%；本研究的RP-HPLC测定法的回收率较好,方法是可行的。
       表2  超声提取正交实验结果（略）表3  和厚朴酚回收率  （略）表4  厚朴酚回收率 （略）
       3  讨论
       厚朴是一种应用较广的重要中药材，最近的研究表明，其中厚朴酚［4］与和厚朴酚［5］有抑制癌细胞的潜能,厚朴药材将会有更加广泛的医药用途；寻找合适的厚朴皮替代品将具有较大的研究价值。本文首次报道了用超声法提取厚朴药材中的厚朴酚与和厚朴酚的研究，超声有助于厚朴酚与和厚朴酚的提取，适用于工业化生产的放大工艺正在进一步研究中。
       厚朴叶中总酚的含量是未发汗厚朴皮的1/4，提示厚朴叶有替代厚朴皮入药的潜能，今后如有进一步的药理学研究证实厚朴叶可替代厚朴皮入药，在很大程度上有利于保护厚朴树资源；然厚朴叶中的厚朴酚与和厚朴酚的含量组成与皮有差异，入药时应综合考虑。
       【参考文献】
         　　［1］国家药典委员会.中国药典,Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社,2005:359,525,563,660.
       
       ［2］沈映君. 中药药理学［M］. 上海：上海科学技术出版社,1997：82.
       
       ［3］瞿京红.厚朴皮与叶及不同炮制法酚性成分的比较［J］.中国医院药学杂志,2000, 20(l2)：76.
       
       ［4］Lin Shyr-Yi, Liu Jean-Dean, Chang Hui-Chiu, et al. Magnolol suppresses proliferation of cultured human colon and liver cancer cells by inhibiting DNA synthesis and activating apoptosis［J］.Journal of Cellular Biochemistry,2001,84(3)：532.
       
       ［5］Xianhe Bai, Francesca Cerimele, Masuko Ushio-Fukai, et al. Honokiol, a Small Molecular Weight Natural Product, Inhibits Angiogenesis in Vitro and Tumor Growth in Vivo.［J］.J. Biol. Chem, 2003, 278(37)：35501.