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       【摘要】 
       目的建立苯酚－硫酸法测定大蒜多糖组分B的含量。方法采用醇沉的方法分离纯化大蒜多糖组分B，以苯酚-硫酸显色后用紫外分光光度计测定吸光度,测定波长486 nm。结果在4.0～10.0 μg/ml内，浓度与吸光度呈良好线性关系。回归方程：A=0.069 4C-0.004 9 (r=0.999 6，n＝7)，平均回收率为101.27％ ，RSD为1.9％。大蒜多糖组分B的平均糖含量为83.37% ，RSD为2.5％(n=5)。结论该方法简便、准确、精密度高、重现性好,为生产的质量控制及进一步研究奠定良好的基础。
       【关键词】  大蒜多糖组分B 苯酚-硫酸法 含量测定
       Purification and Determination of Polysaccharides B from Garlic
       YU Wei, ZHA Wenliang, XIA Yong, WU Jiliang, CHEN Feng
       (1.Pharmacyological College of Xianning University，Xianning  437100，China; 2.Medical College of Xianning University,Xianning 437100, China)
       Abstract:ObjectiveTo develop phenol-sulfuric acid method for the determination of polysaccharides B from garlic.MethodsGarlic Polysaccharides B was extracted and purified through ethanol precipitation, the content was determined by phenol-sulfuric acid at 486 nm. ResultsIn the range of 4.0～10.0 μg/ml, there was an excellent linear shape between the concentration and absorbence. The regression equation was A=0.069 4C-0.004 9(r=0.999 6,n=7)and the average recovery was 101.27% with RSD=1.9%. The average polysaccharides content B from garlic was 83.37%,RSD=2.5% (n=5). ConclusionThe method is simple and accurate and it can be used for the quality control of polysaccharides form garlic.
       Key words:Garlic polysaccharides B；  Phenol-sulfuric acid；  Content determination
       多糖的研究起自20世纪60年代，从20世纪70年代开始逐渐发现多糖及其复合物(蛋白多糖和脂多糖)具有多方面的药理作用，主要包括：增强免疫、抗肿瘤、活血抗栓、降血压、降血脂、降血糖、抗衰老、增强骨髓造血机能、抗辐射、对肝肾等主要脏器具有保护作用。中药多糖的化学研究范围涉及提取、分离、纯化等方面［1,2］。目前我国对大蒜多糖的研究主要在于药理方面［3,4］，涉及结构分析、定性定量、分子量确定等领域较少。大蒜多糖是大蒜的醇沉部分，有大蒜多糖组分A、B和C 3种成分，笔者对大蒜多糖组分B进行了含量测定，旨在为大蒜多糖的研究提供基础资料。
       1  材料与仪器
       1.1  药材市售山东产大蒜。
       1.2  试剂葡萄糖标准品，上海化学试剂公司；苯酚，上海化学试剂公司；硫酸(分析纯)，上海化学试剂有限公司；95％ 乙醇；蒸馏水。
       1.3  仪器UV-754型紫外可见分光光度计；FA1104电子分析天平。
       2  方法与结果
       2.1  大蒜多糖组分B的分离纯化新鲜大蒜去皮碾碎，无水乙醇浸泡脱脂，在沸水浴中用4～5倍双蒸馏水提取8 h，滤液用乙醇沉淀，得多糖组分B粗品，粗品用Sevage法去蛋白后在55℃下干燥至恒重得大蒜多糖组分B 精制品。纯化后大蒜多糖在紫外可见光谱段进行扫描，结果显示在190 nm处有多糖的特征吸收峰，而在260和280 nm 处无吸收，表明大蒜多糖组分B中无蛋白质成分。 见图1。
       2.2  试剂的配制
       2.2.1  标准品溶液的制备精密称取105℃干燥至恒重的葡萄糖7.0 mg置100 ml容量瓶中，加水溶解，稀释至刻度，摇匀即得浓度为70 μg/ml的标准品溶液。
       2.2.2  供试品溶液的制备精密称取55℃干燥至恒重的大蒜多糖组分B 10.0 mg置100 ml容量瓶中，加水溶解，稀释至刻度，摇匀即得浓度为100 μg/ml的多糖供试品液。
       2.2.3  5%苯酚试剂的配制取苯酚100 g，加铝片0．2 g和NaHCO3  0.1 g，蒸馏,收集180～182℃ 馏分。精密称取精制苯酚5.0 g以蒸馏水溶解后转至100 ml容量瓶中定容，摇匀，得5%苯酚试剂。
       2.3  检测波长的选择精确量取的葡萄糖溶液、样品溶液1.0 ml分置于两支干燥试管中，分别加入5%苯酚溶液1.0 ml摇匀，然后加入浓H2SO4 5.0 ml摇匀，另以1.0 ml水同上操作，作为空白液，于室温中放置5 min，沸水浴中恒温15 min，取出，冰水浴冷却至室温，在波长400～800 nm之间扫描。结果供试品与标准品溶液在486 nm波长处均有最大吸收，而空白溶液在此波长无干扰，故选用486 nm 为检测波长。见图2～3。
       2.4  标准曲线的绘制精密量取标准品溶液0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0 ml，分别置7只试管中，各加蒸馏水至1.0 ml，再加5％苯酚溶液1.0 ml，摇匀后再加入浓H2SO4 5.0 ml，摇匀，室温下放置5 min，沸水浴中恒温15 min，取出，冰水浴冷却至室温，在486 nm处，以蒸馏水管作为空白对照，测定各浓度标准液的吸光度，以糖浓度C为横坐标，吸光度A为纵坐标绘制标准曲线，计算得回归方程A=0.069 4C-0.004 9 (r=0.999 6，n=7），两者相关性较好。
       2.5  换算因素的测定精确量取供试品溶液2.0 ml，按测定标准曲线同样的方法测其吸光度值。按下式计算换算因素f＝1.11。
       f=W/C×D
       W为大蒜多糖质量（μg），C为供试品溶液中葡萄糖的质量浓度（μg/ml），D为多糖的稀释倍数。
       2.6  精密度实验随机取标准曲线绘制中其中一支葡萄糖试管液，反复测量该标准液的吸光度5次，RSD=0.18％。结果见表1。表1  精密度实验（略）
       2.7  稳定性实验精密量取50 μg/ml多糖样品1.0 ml ，按测定标准曲线同样的方法操作每隔20 min测定吸光度1次，观察的样品溶液在100 min内吸光度的变化情况，算得吸光度的RSD=0.23％，结果表明样品溶液在100 min内显色稳定。结果见表2。表2  稳定性实验（略）
       2.8  重现性实验精密称取同一批次大蒜多糖组分B 5 mg各5份分别置于5个100 ml容量瓶中以蒸馏水定容，得50 μg/ml的多糖样品溶液，量取各样品液1.0 ml于5支干燥试管中，按测定标准曲线同样的方法操作,在486 nm处分别测定其吸光度，算得其RSD=2.52％。
       2.9  多糖含量的计算精密称取多糖5.0 mg，用蒸馏水溶解后定容到100 ml，得样品溶液50 μg/ml。取样品液1.0 ml，按测定标准曲线同样的方法操作并测其吸光度，按下式计算算得平均糖含量为83.37%。结果见表3。表3  多糖含量的计算（略）
       多糖含量(%)=(C×D×f)/W×100％
       C为测得样品溶液中葡萄糖的浓度(μg/ml)；D为样品溶液的稀释倍数；f为换算因素；W为大蒜多糖质量(μg)。
       2.10  回收率实验精密量取已知浓度的样品溶液1.0 ml于试管中，加入与样品浓度相近的葡萄糖溶液1.0 ml，按测定标准曲线同样的方法操作，算得样品的平均加样回收率为101.27％，RSD=1.91％,表明本方法准确度良好。
       3  讨论
       多糖的研究发展很快，但研究层次及技术水平都还较低，为了比较、评价以多糖为有效成分的药材和药品质量，因此多糖的提取和含量测定的研究具有重要意义。本实验通过无水乙醇醇沉和Sevage去蛋白的方法提取大蒜多糖组分B，并运用苯酚—硫酸比色法［5］，通过紫外分光光度计对大蒜多糖糖含量的测定进行了精密度、重现性、稳定性、回收率等各项指标的详细考察，测得多糖的含量为83.37％，RSD为2.5％，结果表明上述提取及含量测定方法适用于大蒜多糖组分B。
       【参考文献】
         　　［1］王玉华, 袁久荣.中药多糖的化学研究概况［J］.中成药, 2004,26(6):497.
       
       ［2］赵文彬,成玉怀.天山大黄多糖的超声提取及含量测定［J］.时珍国医国药，2006, 17( 2)：223.
       
       ［3］蔡飞,陈金和,吴基良.大蒜多糖对小鼠病毒性心肌炎的治疗作用［J］.武汉大学学报·医学版，2003,24(2):109.
       
       ［4］吴基良,余 薇,汪晖，等.大蒜多糖对中毒性心肌炎心肌细胞凋亡的影响［J］.中国生物工程杂志，2005,25(3):40.
       
       ［5］郭 辉,张红旭,曲 枫，等. 红毛五加多糖胶囊中多糖含量测定［J］.时珍国医国药，2004,15(11):735.