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       【摘要】 
       目的研究毛冬青总木脂素配糖体最佳提取工艺，并将总木脂素配糖体进行纯化鉴定。方法采用正交实验，考察乙醇浓度、提取温度、固液比及提取时间4个因素对该工艺的影响；利用D101大孔树脂分离纯化毛冬青总木脂素配糖体。结果确定了毛冬青木总脂素配糖体的最佳提取工艺为：提取时间为1.5 h，提取温度为80℃，乙醇浓度70%，固液比1∶5；纯化后的总木脂素配糖体经红外光谱初步鉴定与tortoside A对照品都具有木脂素母核的基本结构特征。结论优选出的最佳提取工艺条件及纯化总木脂素配糖体的方法，对进一步的工艺开发有较好的参考价值。
       【关键词】  毛冬青 木脂素配糖体 提取工艺 纯化 鉴定
       Extraction, Purification and Characterization of Total Lignans from  Ilex pubescens Hook. et Arn.
       ZHOU Zhongliu, ZOU Jieming, WANG Lisheng, ZENG Li,  YIN Wenqing
       (1.School of Chemistry & Chemical Engineering, Guangxi Normal University, Guilin 541004, China;2. Guilin Sanjin Pharmaceutical Co. Ltd., Guilin 541004, China)
       Abstract:ObjectiveTo study the optimum extraction process for the total lignans from Pubescent Holly root, and lignans was purified and characterized. MethodsBy orthogonal design, the effects of concentration of ethanol, temperature, ratio of solid to liquid and time of extraction on the total lignans extraction rate were investigated.The total lignans were separated and purified by D-101 porous resin absorption.  ResultsThe optimum extraction condition was at temperature of 80 ℃, concentration of alcohol was 70%, solid / lipuid ratio was 1:5 and extraction time was 1.5 h. Its structure was characterized by IR spectrum, the result showed that both the total lignans and tortoside A had the same constructure fractions. ConclusionThe optimum extraction condition and purification experiment are very useful for further development of industrial process.
       Key words:Ilex pubescens Hook. et Arn.;   Total lignans;   Extracting process;   Purification;   Characterization
       毛冬青Ilex pubescens Hook. et Arn是冬青科冬青属下的一种植物，常绿灌木，产于广东、广西、安徽等地。毛冬青的根是我国江南一些省区民间常用药，经现代药理实验和临床应用证明，是治疗心血管疾病较好的药物［1］。据文献报道［2］，毛冬青根中含liriodendrin、tortoside A、(+)-medioresinol di-O-β-D-glucopyranoside、(+)-pinoresinol-4,4"-O-bisglucopyranoside等木脂素成分，都是以木脂素为苷元的配糖体，结构在局部有高度的对称性。据报道［3］它们用来制备补药，能够降压，调节神经系统，增强身体抵抗力，且对血压有双相调节等功效。
       毛冬青根中总木脂素配糖体的提取工艺尚未见报道，本文拟通过正交实验研究毛冬青根中总木素配糖体的最佳提取工艺条件，以总木脂素配糖体提取率为指标，系统地考察了溶剂浓度、固液比、提取时间、提取温度等因素的影响，最后优选出最佳提取方案，并对采用该方案提取的毛冬青总木脂素配糖体进行分离、纯化及鉴定，为本地毛冬青及毛冬青木脂素配糖体的开发利用提供实验数据和理论指导。
       1  器材与方法
       1. 1   材料与试剂
       毛冬青干燥根由广西柳州市中药饮片厂提供，药材经由广西师范大学生命科学院唐绍清教授鉴定为冬青科植物毛冬青Ilex pubescens Hook. eL Am的干燥根；木脂素配糖体tortoside A对照品系笔者从广西毛冬青根中分离得到的单体，其它试剂均为分析纯。
       1.2  仪器
       TU-1901双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；电子天平（沈阳龙腾电子称量仪器有限公司）。
       1.3  方法
       1.3.1  样品提取工艺称取毛冬青干燥根粗粉100.0 g，按表1所示的正交条件，采用不同体积分数的乙醇加热回流提取，合并所得浸膏加水溶解，依次用石油醚、水饱和的正丁醇萃取，减压蒸干萃取液，干燥得到粗提物用150 ml甲醇溶解，作为待测液。
       1.3.2  毛冬青干燥根中总木脂素配糖体的定量测定以木脂素配糖体tortoside A为对照品，用分光光度法测定木脂素配糖体含量并计算毛冬青总木脂素配糖体提取率。
       总木脂素配糖体提取率（%） = ［(提取液中木脂素配糖体总量) ／(所用毛冬青干燥根原料量) ］×100%
       1.3.3  正交实验选取乙醇浓度、提取温度、固液比及提取时间四因素作L9(34)正交实验，（见表1，2）。并对结果进行方差分析和显著性检验。见表3。表1  正交实验因素水平（略）表 2   L9(34)正交实验结果（略）表3  正交实验方差分析（略）
       2  结果
       2.1   毛冬青总木脂素配糖体的定量测定
       2.1.1   标准溶液和标准曲线的测定tortoside A 对照品经无水甲醇溶解后于TU-1901双光束紫外可见分光光度计上作最佳吸收波长扫描并绘制扫描曲线，实验结果显示在275 nm处有最大吸收且反应3 h内其吸光度保持稳定。
       精确称量木脂素配糖体tortoside A对照品5 mg，用无水甲醇溶解并定容至25 ml，再依次配制成5，10，15，20，40，80  μg/ml的标准溶液，以无水甲醇为空白，在275 nm处测定吸光度，回归分析得到标准曲线为 Y = 0.021 4X+0.035，式中Y为吸光度，X为tortoside A含量 (μ g/ml)，X的取值在5 ～ 80 μg范围内线性关系良好，相关系数r = 0.998 9。
       2.1.2  毛冬青总木脂素配糖体的提取率测定精确吸取“1.3.1”项下待测液0.2 ml并稀释定容至25 ml，在275 nm处测定吸光度，从而可以得到毛冬青总木脂素配糖体的提取率。结果见表2。
       2.2  正交实验的设计及结果用乙醇为溶剂提取的4因素、3水平正交实验因素、水平见表1，结果见表2。对表中总木脂素配糖体提取率进行方差分析和显著性实验，结果见表3。表2中出现的k1 , k2 , k3 分别代表某个因素的不同水平的指标值加和，K1 , K2 , K3分别代表某个因素的不同水平的指标平均值，R代表极差。
       通过比较各因素的极差值 (R)可以看出，影响总木脂素配糖体提取率的因素顺序为D>A>C>B，具体见表2。从表3可以看出，乙醇浓度和提取时间对毛冬青总木脂素配糖体的提取有显著性影响，并考虑总木脂素配糖体的提取率和实际生产情况，最终确定的最佳提取工艺条件为：D1A1C1B3，即乙醇的体积分数为70%，固液比为1∶5，提取时间为1.5 h，提取温度为80℃。此条件下提取后测得总木脂素配糖体的含量为0.438%。
       2.3  最佳提取工艺的验证精密称取3份干燥的毛冬青干燥根50.0 g，按最佳工艺条件平行操作，按照“1.3.1”项下和“1.3.2”项下测定吸光度，根据回归方程得出毛冬青总木脂素配糖体的含量，其结果见表4。由表4最佳工艺验证结果表明，用最佳工艺条件提取，毛冬青总木脂素配糖体提取率均高于其它各正交实验值，故本最佳工艺条件合理。同时RSD=2.2%也表明此工艺重复性好，具有较好的稳定性。
       2.4   毛冬青总木脂素配糖体的纯化称取500 g的毛冬青干燥根粉末按正交实验中确定的方法提取，减压浓缩至无醇味，加蒸馏水溶解，静置过夜，过滤，将滤液稀释定容至1 000 ml。定量取100 ml溶液，加到已经预处理好的D101大孔树脂柱上，先用蒸馏水洗脱，除去糖类、无机盐等不易被吸附的物质，然后用30%的乙醇水溶液进行洗脱，合并洗脱液并浓缩至干，得到干燥浸膏。然后按“2.1.2”项操作，测定吸光度，根据回归方程计算纯化后上述浸膏中总木脂素配糖体的含量，所得总木脂素配糖体的纯度为51.6%。表4  最佳工艺验证结果（略）
       2.5  毛冬青总木脂素配糖体的初步鉴定
       2.5.1  定性检测按照毛冬青木脂素配糖体的定性检测方法进行试验，FeCl3反应和Molish反应检测现象明显，初步说明纯化后的毛冬青浸膏中含有木脂素配糖体。
       2.5.2  红外光谱检测取毛冬青提取纯化后的样品毛冬青总木脂素配糖体与 tortoside A对照品分别用KBr压片，在红外光谱仪上进行扫描，所得谱图见图1～2。从图1的红外光谱中可以看出，在3 444，2 937，2 852，1 595，1 510，1 128，1 081，1 054 cm-1左右有典型的吸收；从图2中同样可以看出，在3 427，2 937，2 856，1 597，1 508，1 128，1 080，1 053 cm-1左右有较明显的吸收峰；通过对比不难发现，纯化后的毛冬青总木脂素配糖体的红外吸收在tortoside A对照品中都可以找到，说明都含有取代苯基、羟基、甲氧基和C-O-C (糖苷键结构片断)，表明提取纯化的毛冬青总木脂素配糖体与tortoside A对照品都具有木脂素糖苷的基本结构特征。两图中存在部分的差异，因为提取纯化的毛冬青总木脂素配糖体中仍然有杂质或含有与tortoside A对照品母核结构有部分差异的木脂素配糖体。
       3  讨论
       毛冬青根的粉碎与否能显著影响提取效率，原因是粉碎能使根皮破裂，有利于溶剂的渗透及有效成分的溶出，因此，提取时应以粗粉为佳。
       通过正交实验，最终确定的最佳提取工艺条件为：D1A1C1B3，即乙醇的体积分数为70%，固液比为1∶5，提取时间为1.5 h，提取温度为80℃。此条件下提取后测得总木脂素配糖体的含量为0.438%。提取时间和乙醇的浓度是影响提取效果的显著因素，因此，在提取过程中要注意控制提取时间和乙醇的浓度。
       本文所用的对照品系笔者从广西毛冬青干燥根中分离得到的木脂素配糖体tortoside A，其晶体经核磁共振图谱、红外、紫外和质谱，结合旋光度和熔点测定，确认其纯度达到98%以上。
       按最佳工艺提取所得的总木脂素配糖体，大孔树脂纯化后测得其含量达到51.6 %，经理化性质和红外光谱检测，毛冬青总木脂素配糖体与tortoside A对照品都具有木脂素糖苷的基本结构特征。
       【参考文献】
         　　［1］熊友香，李昶，罗宪堂. 毛冬青的化学成分、药理作用研究进展［J］.中药材, 2002, 25(5)：371.
       
       ［2］杨鑫，丁 怡，孙志浩，等. 毛冬青的化学成分研究［J］.中草药，2005, 36(8)：1146.
       
       ［3］Junei Kinjo, Katsura Fukui, Toshlhiro Nohara, et al. The first isolation of lignan tri- and tetra-glycosides［J］.Chem.Pharm.Bull, 1991, 39(6)：1623.