青蒿琥酯对人肝癌HEPG-2细胞增殖作用的研究
作者：李静，杨斌， 陈永顺
作者单位：广西医科大学药学院，广西 南宁 530021
《时珍国医国药》 2008年 第4期
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【摘要】
目的研究青蒿琥酯（Artesunate,Art）对肿瘤细胞增殖抑制作用。方法MTT法测定Art，与铁剂联用，以及与5-FU联用对人肝癌细胞系HEPG-2的增殖抑制作用。结果Art能够明显抑制HEPG-2细胞的生长，并呈现明显的时间－剂量效应。24，48，72 h的IC50值分别为103.1，75.3，65.7 μg/m。当Art（10μg/ml)与5-氟尿嘧啶（5-Fu）（5μg/ml）联合使用时，表现出明显的协同作用。结论Art对人肝癌细胞系HEPG-2细胞有显著的抑制作用，有可能开发为临床抗癌治疗的辅助药物。
【关键词】 青蒿琥酯 HEPG-2
Experimental Study on the Effect of artesunate(Art) on HEPG-2 Cells in Vitro
LI Jing,YANG Bin，CHEN Yongshun
（Guangxi Medical University,Nanning，530021，China）
Abstract：ObjectiveTo study the effect of artesunate(Art) on HEPG-2 cells in vitro.MethodsCell culture, MTT were performed to observe the proliferation of Art, combining with iron,5-FU. ResultsArt（50～200μg/ml）could inhibit HEPG-2 cell proliferation in a time-dose dependent manner and IC50 were 103.1,75.3,65.7μg/ml in 24h,48h,72h respectively. When Art(10μg/ml) was used combining with 5-Fu（2.5μg/ml）, there was obvious synergies.ConclusionArt could significantly inhibit the proliferation of HEPG-2.
Key words：Art; HEPG-2
青蒿琥酯（artesunate，Art）是从天然植物青蒿中提取的一种含内过氧化基团的倍半萜内酯化合物,其结构具有一定的新颖性，临床上主要用于抗疟治疗。目前的研究发现，其还具有抗肿瘤效应［1，2］。本实验研究了Art对体外培养的人肝癌细胞系HEPG-2细胞增殖的影响。现报道如下。
1 器材
1.1 仪器
全自动CO2孵箱(美国Thermo Formo)，倒置显微镜(日产)，雷勃MK3酶标仪。
1.2 试剂
RPMI-1640培养液(美国Gibco公司)；小牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；四唑盐(MTT)，二甲基亚砜(DMSO)均购自Sigma公司；Art购于桂林制药厂；5-FU购于广西医科大学第一附属医院药剂科；硫酸亚铁为分析纯。
1.3 细胞株和细胞培养人肝癌HEPG-2细胞株从广西医科大学肿瘤医院细胞室引进，培养在含10%小牛血清，含青链霉素各100 u/ml的RPMI-1640培养液中，37℃，5%CO2饱和湿度条件下培养，0.25%胰蛋白酶消化传代。
2 方法
2.1 MTT法检测细胞的增殖活性、青蒿琥酯IC50值的测定采用MTT法，取对数生长期的HEPG-2细胞，按每孔细胞3×103～5×103个，190 μl接种于96孔培养板中，每组设6个复空，12 h贴壁后加入各组药物，药物终浓度梯度为200，100，50μg/ml，37℃ ，5%CO2饱和湿度下培养24，48，72 h，OD值测量波长为双波长570 nm/630 nm，以下列公式计算抑制率：抑制率（%）=(1-加药组OD/对照组OD)×100%，实验重复3次。
2.2 Art与铁剂硫酸亚铁作用的研究取对数生长期的HEPG-2细胞，按每孔细胞3×103～5×103个，180 μl接种于96孔培养板中，设置阴性组，Art组，Art与1，2 μg/ml铁剂联合作用组，细胞12 h贴壁后加入各浓度Art，以及终浓度分别为1，2 μg/ml的铁剂，检测方法同上。
2.3 与抗癌药的协同作用研究取对数生长期的HEPG-2细胞，按每孔细胞3×103～5×103个，180 μl接种于96孔培养板中，，设阴性组，5-Fu组，5-Fu与10，20 μg/ml Art联合用药组,12 h贴壁后加入各组药物，检测方法方法同上。
3 结果
3.1 Art的IC50值 细胞每个浓度梯度的抑制率得出后，采用Bliss法求得Art对肝癌HEPG-2细胞的24，48，72 h的IC50分别为(103.1±8.6)，(75.3±4.1)，(65.7±6.0) μg/ml。结果见表1。表1 Art各浓度的抑制率(略)
100 μg/ml浓度组和200 μg/ml浓度组，与50 μg/ml浓度组比较，P<0.05，有统计学意义；n=3
3.2 与硫酸亚铁联用结果Art终浓度为50，100，200 μg/ml，分别与硫酸亚铁终浓度为1，2 μg/ml联合作用，各联合组抑制率与单用Art组抑制率之间比较，P>0.05，没有统计学意义。结果见表2。表2 Art与硫酸亚铁联用的抑制率(略)
3.3 与5-Fu联用结果Art终浓度为10，20 μg/ml与5-Fu终浓度为2.5，5，10，20 μg/ml联合作用，在5-Fu 5 μg/ml时加入Art10 μg/ml或20 μg/ml，与单用5-Fu比较，P<0.05有统计学意义。结果见表3。表3 Art与5-FU联用的抑制率(略)
4 讨论
Mosmann(1983)首先报道用MTT方法检测细胞活性，此方法简便、快速，所需细胞较少，目前已广泛用于临床前抗癌药物筛选研究［3］。本实验采用MTT法,求出Art各浓度对人肝癌细胞系HEPG-2的抑制率，且最高抑制率近80%，并有明显的时间－剂量效应，采用Bliss法求得Art对肝癌HEPG-2的24，48，72 h的IC50分别为(103.1±8.6)，(75.3±4.1)，(65.7±6.0)μg/ml。
研究认为，青蒿素衍生物对肿瘤的细胞毒作用与其抗疟作用机理相似，由于疟原虫与肿瘤细胞具有一个共同特点：高铁浓度。而青蒿素结构中拥有独特过氧桥结构，且过氧桥结构为其药理活性所必须。实验证明，青蒿素类药物是在铁元素介导下，分子内过氧桥裂解产生活性自由基发挥作用，损伤机体细胞膜结构和烷化生物大分子，诱导肿瘤细胞凋亡，且其作用与细胞内铁离子水平成正相关［4］，如果使用全铁转铁蛋白可显著提高癌细胞内的Fe2+ 更可以增加ART的抗肿瘤作用［5］。本实验发现，通过添加硫酸亚铁，其终浓度分别为1，2 μg/ml未见提高Art对肿瘤细胞的抑制作用，其原因可能是对肿瘤细胞有一定的选择性。
传统的抗癌药如5-Fu，环磷酰胺，阿霉素等毒副作用较大，且有不同程度的致突变毒性，病人常难以承受。因此，人们把目光转向中药，试图从天然植物成分中寻找毒副作用小，作用独特的抗癌药物。而Art具有化学结构独特，抗癌效果显著，毒副作用低，且不易产生耐药性等优点，因而与现有化疗药物联合使用，可能会取长补短，减毒增效，并提高肿瘤治疗的特异性。本实验对Art与5-Fu按不同比例联合使用的效果进行比较，结果显示Art（10 μg/ml)与5-Fu（5 μg/ml）联合使用时，表现出明显的协同作用，这种协同作用可使抗癌药的有效浓度降低，减轻抗癌药的毒性，增加抗癌效果，提示Art有可能作为临床抗癌治疗的辅助药物。
【参考文献】
［1］Posner GH,Northrop J,Paik IH,et al.New chemical and biological aspects of artemisinin-derived trioxane dimmers［J］.Bioorg Med Chem 2002;19(1) ：227.
［2］Galal AM,ross SA,Elsohly MA,et al .Deoxyartemisinin derivatives from photooxygenation of anhydrodeoxy dihydroartemisinin and their cytotoxic evaluation［J］.J Nat Prod 2002:65(2) ：184.
［3］司徒镇强，吴军正.细胞培养［M］.西安：世界图书出版公司，2004：199.
［4］Rosenthal P J，Meshnick S R．Hemoglobin catabolism and iron utilization by malaria parasites［J］.Mol Biochem Parasitol，1996，83(2)：131
［5］周从明，王小渝，吴康玉，等. 青蒿琥酯的抗肿瘤作用研究［J］.四川肿瘤防治，2006，19（2）：89.