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       【摘要】 
       目的研究裙带菜茎多糖体外抗单纯疱疹病毒1型（HSV-1）活性。方法采用空斑减数实验测定裙带菜茎粗多糖及纯化后多糖抗HSV-1活性，计算它们的空斑抑制率和IC50，并从药物对病毒的直接灭活作用、对病毒吸附的影响及对病毒释放的影响3个方面初探裙带菜茎多糖抗单纯疱疹病毒活性机理。结果裙带菜茎多糖能明显抑制HSV-1的致病变作用，IC50依次为 8.04，13.54 μg/ml。药物对病毒没有直接灭活作用，对病毒的释放也没有影响，主要影响了病毒的吸附。结论裙带菜茎多糖有显著的抗HSV-1活性,且粗多糖比纯化后多糖活性要好，并且可以初步推测裙带菜茎多糖抗HSV-1活性是作用在病毒和受体结合、侵入Vero细胞阶段。
       【关键词】  裙带菜茎 细胞病变效应法(CPE) MTT法 空斑抑制率
       Study on the Antivirus Activity of Crude Polysaccharide Extracted from the Caudex of Undaria pinnatifida in vitro
       HAO Jing, WANG Yifei, ZHANG Meiying, LIU Qiuying, KANG Yanyan
       1.Guangzhou Jinan Biomedical Research and Development Center,guangzhou,510632,China;
       2.Guangdong Provincial Institute of Sports Science,Guangzhou 510663, China
       Abstract:ObjectiveTo investigate the activities of anti-Herpes simplex 1 virus of polysaccharide extracted from the caudex of Undariapinnatifida.MethodsHSV-1 was inoculated on Vero cells, polysaccharide extracted from the caudex of Undaria pinnatifida was added to the medium in various concentrations. After 72 hours incubation, plaques were counted and the 50% inhibiting concentration (IC50) was calculated in Plaque reduction assay . Initial studies on antivirus mechanism in three aspects: virus inactivation, the drug influence on virus absorption and release  were performed.ResultsPolysaccharide had conspicuous anti-Herpes simplex 1 virus activities, their IC50 were  8.04 μg/ml，13.54 μg/ml respectively. The drug had no influence on inactivating virus and release from the cell, however, it had influence on virus absorption.ConclusionPolysaccharides extracted from the caudex of Undaria pinnatifidahas has conspicuous anti-Herpes simplex 1 virus activity, and the activity happens in the binding, absorpting stage of HSV-1 release with Vero cell.
       Key words:The caudex of Undaria pinnatifida;  CPE;  MTT test;  Plaque reduction ratio
       人类单纯疱疹病毒1型（Herpes simplex 1 virus ，HSV-1）可引起唇疱疹、疱疹性角膜结膜炎和新生儿脑炎等多种疾病，艾滋病、癌症和器官移植等免疫低下者感染HSV-1 的危险性大大增加。HSV-1 感染所导致的疤痕化，已成为发达国家失明的主要原因。而目前临床常用的治疗药物主要是无环鸟苷(ACV)等核苷类，其作用靶点是病毒DNA聚合酶，进而影响病毒的复制，但其毒性大，加之容易产生耐药性、抗病毒谱窄且价格高昂，故筛选研制毒性小，作用机理不同的抗病毒药物尤为重要。
       裙带菜Undaria  pinnatifida又名海芥菜，隶属于褐藻门(Phaeophyta)、游孢子纲(Phaeosporeae)、海带科(Laminariaceae)、裙带菜属(Undaria), 从裙带菜茎中提取的水溶性多糖主要由硫酸多糖组成，有广泛的营养价值和药用价值，同时还可以达到“变废为宝”的目的。本文以Vero细胞作为体外筛选细胞模型检测并比较不同剂量裙带菜茎硫酸粗多糖和纯化后多糖对单纯疱疹病毒1型的抑制作用，并对其抗病毒活性机理进行了初步探讨，为从传统中药中筛选新型抗病毒药物及进一步研究抗HSV-1活性机理提供参考依据。
       1  材料
       四甲基偶氮唑（MTT），美国SIGMA 公司；十六烷基磺酸钠（SDS），美国PROMEG公司；无环鸟苷(ACV)购于湖北科益药业股份有限公司；单纯疱疹病毒1型HSV-1 F株来源于武汉大学病毒研究所；Vero细胞购于美国ATCC公司。
       
       新鲜裙带菜于2004年采自大连海面。由本实验室工作人员经水提醇沉法得到裙带菜茎粗多糖UPP1［1］。主要理化性质研究可得：黄褐色粉末，氯化钡-明胶法测定粗提物硫酸根含量为16.94%。UPP1 经过脱色，去蛋白处理后，又经过DEAE cellulose-52离子交换柱分级洗脱和SephadexG-200凝胶柱纯化得到其中的一个组分UPP2。其主要的理化性质是：白色絮状，相对分子量为2.06×105，主要由岩藻糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖组成。氯化钡-明胶法测定粗提物硫酸根含量为19.62%。
       2  方法
       2.1  病毒滴度测定将毒株作10倍系列稀释,常规方法感染单层Vero细胞, 37℃、5％CO2培养3 d, CPE法观察细胞病变情况,按Reed Muench［2］方法计算TCID50。
       2.2  细胞毒性测定在单层Vero细胞中,加入7个不同浓度(1 000，500，250，125，62.5，31.25，15.625 μg/ml)多糖稀释液,设4个复孔, 5％CO2培养2 d后，参考Mosmann［3］建立的MTT法,每孔加入5 mg/ml MTT 10 μl, 5％CO2培养4 h,弃上清液，加入10% SDS 100 μl过夜，酶标读数仪比色(波长570 nm，参比波长630 nm),测吸光度Ａ值并计算细胞存活率、药物的半数毒性浓度（50% cytotoxic concentration，TC50），细胞存活率（％）=实验组A570/对照组A570×100％，同时设阿昔洛韦阳性药物对照组和正常细胞对照组。
       2.3  药物抗病毒的药效学实验（空斑减数实验）弃液，PBS洗涤一遍，将药物和病毒稀释液（40万倍稀释）各100 μl混合后加入细胞中，设3个复孔，设阳性对照组、病毒对照组和正常细胞对照组（下同），5％CO2培养箱孵育2 h，加入由2倍的DMEM维持液和1%羧甲基纤维素以1∶1的比例配成的完全覆盖液1 ml，观察72 h后，10%甲醛固定10 min，1% 结晶紫染色30 min，用清水漂洗、晾干，参照Nitta［4］的方法清点空斑数, 计算空斑抑制率。空斑抑制率（%）=(病毒对照组空斑数－药物处理组空斑数)/(病毒对照组空斑数)×100%，以药物浓度的对数值做横坐标，以空斑抑制率做纵坐标作图，根据空斑抑制率结果做出病毒对药物的敏感性曲线，由此得出药物的半数抑制浓度(50% inhibiting concentration，IC50),实验重复3次。
       2.4  药物抗病毒作用机理
       2.4.1  多糖对HSV-1病毒的直接作用取不同稀释度(100，25，6.25，1.56 μg/ml)的裙带菜茎粗多糖UPP1各100 μl分别与HSV-1病毒稀释液（1∶500）100 μl混合，37℃孵育2 h。
       将各浓度药物与病毒的混合液加入到单层Vero细胞中，以PFU法滴定病毒。
       2.4.2  多糖抑制HSV-1病毒的吸附不同浓度(100，25，6.25，1.56 μg/ml) 裙带菜茎粗多糖UPP1加入已长成单层的Vero细胞，每孔加入200 μl，每一浓度设4个孔，于37℃，5％CO2培养箱孵育作用3 h。
       
       弃药液，用PBS洗2遍，加入100 μl适当稀释病毒液，37℃吸附2 h，吸出各孔病毒液，以PFU法滴定病毒。
       2.4.3  多糖对HSV-1病毒释放的影响不同稀释度(100，25，6.25，1.56 μg/ml)的裙带菜茎粗多糖UPP1 加入已感染病毒的24孔细胞板，每一浓度4孔，置5% CO2孵箱中37℃培养。
       待病毒对照病变达++++时，终止培养，吸出每孔培养液，-70 ℃冻存备滴定培养液内病毒，细胞亦冻存。
       用PFU法滴定病毒，细胞内病毒滴定前进行3次冻融。
       2.5  结果的统计学处理细胞毒性实验数据以±s表示，作t检验。
       2.6  抗病毒效果的评价通过比较UPP1，UPP2的TC50，IC50，治疗指数（TI=TC50/IC50药物的安全范围IC50～TC50）来评价它们的抗病毒效果。
       3  结果
       3.1  病毒滴度按Reed-Muench法计算病毒的TCID50为10-5.5，即接种滴度为10-5.5的病毒每孔0.1 ml,可使50%细胞发生明显病变。实验用病毒浓度为100 TCID50。
       3.2  细胞毒性测定MTT测得细胞存活率见表1，可见裙带菜多糖对Vero细胞毒性很小，甚至没有，UPP1 的毒性要小于UPP2（实验结果未列出）。ACV的TC50为656 μg/ml。
       表1  裙带菜茎硫酸多糖对Vero细胞的毒性作用（略）
       3.3  药物抗病毒的药效学实验病毒对照组的平均空斑数为25.5，不同浓度多糖作用下的平均空斑数和空斑抑制率见表2,通过作图及对数计算得裙带菜茎多糖的IC50分别为8.04，13.54 μg/ml。表2  裙带菜茎多糖抑制HSV-1的平均空斑数和空斑抑制率（略）
       3.4  抗病毒效果的评价裙带菜茎多糖抗病毒效果如表3所示。可以看出裙带菜茎多糖的细胞毒性远远小于阿昔洛韦，裙带菜粗多糖的抗病毒效果比纯品要好的多，其IC50 只有纯品的1/2左右，治疗指数也大大提高，药物的安全性大大增强。
       3.5  抗病毒活性机理
       3.5.1  对病毒的直接灭活作用裙带菜茎粗多糖UPP1各稀释度与病毒稀释液等体积混合，37℃作用2 h后经PFU法滴定结果如下表4所示：各组PFU值相差无几，表明裙带菜茎粗多糖对HSV-1没有直接的灭活作用。表3  裙带菜茎多糖抗HSV-1 活性结果（略）
       3.5.2  对病毒吸附的影响多糖抑制病毒的吸附的结果见表5，结果表明实验组中细胞外病毒液中的病毒颗粒有明显的增多，100，25，6.25，1.56 μg/ml裙带菜茎粗多糖实验组培养液平均病毒残留量分别为3.4×104，2.1×104，1.7×104，1.6×104 pfu/ml均明显地高于病毒对照组（1.2×104 pfu/ml），可见用裙带菜茎粗多糖预处理细胞，可使吸附接种病毒后培养液病毒残留量明显增加，明显地抑制病毒对Vero细胞的吸附，影响到HSV-1病毒进入细胞。
       表4  裙带菜茎粗多糖（UPP1）对HSV-1的直接灭活作用结果（略）表5  裙带菜茎粗多糖（UPP1）对HSV-1吸附的影响（略）
       
       3.5.3  对病毒释放的影响多糖对病毒释放的结果见表6，结果表明在所用浓度范围内，裙带菜茎多糖对病毒释放未见明显影响，说明裙带菜茎多糖不影响病毒从感染细胞中释放。实验组细胞内的病毒与细胞内外全部病毒滴度的比率与对照组无明显差异。表6  裙带菜茎粗多糖（UPP1）对HSV-1释放的影响（略）
       4  讨论
          
       人类单纯疱疹病毒1型（HSV-1）感染可引起多种疾病，发病率近年来持续上升。疱疹病毒耐药株的出现，使HSV感染相关的疾病遇到了严重挑战。而临床上常用的核苷类药物阿昔洛韦（ACV）等主要作用于DNA聚合酶，交叉耐药现象十分严重，故需要不断寻找新的抗疱疹病毒药物，或提高现有药物的利用度。
       自1987年发现硫酸酯化葡聚糖具有抑制艾滋病病毒（HIV）活性以来,多糖硫酸化的抗病毒活性研究成为热点。Lee JB等［5］发现从Monostroma latissimum 中分离的天然硫化多糖有体外抑制HSV-1 复制的作用，其作用机制为抑制病毒吸附和病毒的后期复制阶段。Xu HX等［6］从Prunella vulgaris 分离出的阴离子多糖有体外抑制HSV-1和HSV-2的作用，其作用机制是通过与病毒竞争细胞受体而发挥抗病毒作用。
       
       本研究通过MTT法测定裙带菜茎多糖对Vero细胞的毒性作用，可以发现，与阳性对照药阿昔洛韦相比，裙带菜茎多糖对细胞几乎没有毒性作用，其TC50均在10 000 μg/ml以上，在低浓度时甚至有促进细胞增长的作用。同时也可以发现，粗多糖比纯品的毒性要低。
       利用空斑减数实验，可以看出裙带菜茎多糖具有明显的抗HSV-1的活性，其IC50值分别为8.04，13.54 μg/ml，尤其是粗多糖的效果好，因此在进一步探讨其抗病毒活性机理的实验中采用了粗多糖，从粗多糖对病毒的直接灭活作用，对病毒吸附的影响，对病毒释放的影响3个方面进行了研究，结果发现，裙带菜茎多糖对病毒没有直接的灭活作用，对HSV-1 病毒的释放也没有影响，主要影响病毒对Vero细胞的吸附，即主要作用在病毒和受体结合、侵入Vero细胞阶段。笔者认为多糖为大分子物质，不能进入细胞，它对病毒的作用机制可能是包裹病毒，阻止病毒的吸附与入胞，或者是通过与病毒竞争受体，而发挥抗病毒的作用。
       治疗指数(TI)体现了药物的安全范围，其值越大表明药物的有效浓度与中毒浓度相距越大，实验结果证实，裙带菜茎粗多糖的安全范围大于纯多糖，大于阿昔洛韦。这表明：与阿昔洛韦等核苷类药物相比，裙带菜茎多糖是一种活性强的纯天然产物，比合成药物毒副作用小，并且具有资源丰富，采集容易，成本低的优势，因此裙带菜具有开发成保健食品、药物的巨大潜力。
       【参考文献】
         　　［1］康琰琰，王一飞，门晓媛，等.裙带菜茎中硫酸多糖的提取工艺［J］.暨南大学学报,2006，27（1）：141.
       
       ［2］傅传华.病毒学实用实验技术［M］.济南:山东科学技术出版社,2001：61.
       
       ［3］Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth survival: Application to proliferation and cytoxicity assays［J］.J Immunol Methods,1983, 65(1):551.
       
       ［4］Nitta K,Shiota H,Nito T,et al. Sensitivities of other antiviral drugs and thymidine kinase activity of aciclovir-resistant herpes simplex virus type1［J］.J Jpn Ophthalmol Soc,1994,98∶513.
       
       ［5］Lee JB,Hayashi K,Hayashi T,et al.Antiviral activity against HSV-1,HCMV,and HIV-1 of Rhamnan sulfate from Monostroma latissimum［J］.PlantaMed,1999,65(5):439.
       
       ［6］Xu HX,Lee SH,Lee SF,et al.Isolation and characrerization of an anti-HSV polysaccharide from Prunella vulgaris［J］.Antiviral Res,1999,44(1):43.