文章标题 全文   多个检索词，请用空格间隔。

       【摘要】 
       目的以微波从黄芪中提取多糖，并测定其含量。方法运用微波技术提取黄芪多糖，采用正交设计法优选苯酚-浓硫酸法显色条件，并测定其多糖含量。结果苯酚-浓硫酸法的最佳显色条件为5%苯酚溶液的用量为1 ml，浓硫酸用量为5 ml，水浴温度为100℃，水浴时间为15 min；微波辅助提取黄芪多糖的最佳功率和时间为900 W和30 min。结论微波辅助提取黄芪多糖，反应速度加快，实验结果令人满意。
       【关键词】  黄芪 多糖 苯酚-硫酸法 微波提取
       Microwave Extraction and Content Determination of Polysaccharides of Radix Astragali
       GONG Suxiao, GAO Zhan, ZHANG Tiejun,YANG Junhong,DI Qianqian
       1. Tianjin Institute of Pharmaceutical Research,Tianjin,300193,China; 2. Tianjin University, Tianjin, 300193, China
       Abstract:ObjectiveTo extract polysaccharides from Radix Astragali. with the microwave technology and determine its content. MethodsThe polysaccharides from Radix Astragali. were obtained by microwave technology. The way of coloration in the process of determining the content of polysaccharides from Radix Astragali was optimized by phenol-sulfuric acid method. ResultsThe optimum way of coloration was obtained as follows：1.0 ml 5%phenol solution was added to 2.0 ml testing solution and mixed. Then 5.0 ml concerntrated sulfuric acid was added quickly drop by drop. After set at ambience for 5 min, heated in boiled water for 15 min, followed by cooling in cold water; the result indicated that the best extraction was carried out under 900W microwave power for 30 min.ConclusionThe polysaccharides can be obtained from Radix Astragali by microwave technology.
       Key wordsRadix Astragali;  Polysaccharides;   Phenol-sulfuric acid method;   Microwave
       黄芪是豆科植物蒙古黄芪 Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge．var．mongholicus(Bge.)Hsiao或膜荚黄芪Astragalus membranaceus(Fisch)Bge．的干燥根，是重要的益气中药，其性甘、温，入肺、脾经，具有补气固表、利尿托毒、排脓、敛疮生肌的功效［1］。黄芪的化学成分主要为多糖类、皂苷类、黄酮类及氨基酸类，另外还含有单糖、低聚糖、黏液质、苦味素、胆碱、甜菜碱、叶酸等成分［2］。黄芪多糖是黄芪补气的主要活性物质，大量体内外实验及临床研究表明，黄芪多糖具有增强机体免疫功能、强心、降压、降血糖、抗应激、抗肿瘤、抗病毒、抗辐射、抗氧化等多种药理功效［3］。
       近年来微波技术在天然产物成分提取领域得到了很大的发展和应用，主要是利用微波的热效应。微波加热具有穿透力强、选择性高、加热效率高、耗能少、成本低、操作简便等特点。微波辅助提取法提取产物的副产品少，易分离提取，且微波加热易使植物细胞壁破裂而有效提高提取率。
       目前黄芪多糖的微波辅助提取的有关报道较少，本文采用微波辅助水提醇析法提取黄芪多糖并用苯酚-浓硫酸法测定多糖含量，为以后黄芪多糖微波提取法的开发利用提供依据。
       1  仪器与材料
       UV-1601型可见紫外分光光度计（日本岛津）。AB-104型电子分析天平（梅特勒-托利多上海仪器有限公司生产）。冷冻干燥机（Edwards）。中空纤维膜（截流 Mr 6 000，天津膜天膜工程技术有限公司）。
       黄芪购于天津市中药饮片厂，经天津药物研究院中药现代研究部张铁军研究员鉴定为蒙古黄芪。葡萄糖（分析纯，天津市化学试剂一厂）。苯酚（分析纯，天津市化学试剂一厂）。硫酸（分析纯，天津市化学试剂三厂）。其它试剂均为分析纯。
       2  方法与结果
       2.1  精制黄芪多糖的制备 
       取黄芪饮片500 g，加入10倍量的蒸馏水70℃浸提2 h，滤过，滤渣加入8倍量水再次提取2 h，滤过。两次滤液合并后浓缩至400 ml，加入2.5倍量95%乙醇，低温静置过夜，离心，沉淀用150 ml蒸馏水溶解后，加入等体积5%三氯乙酸-正丁醇液反复3次除蛋白，离心，上清液用2 mol/L NaOH调pH=7.0，离心，上清液加入2.5倍量95%乙醇4℃静置48 h，离心，沉淀用75 ml蒸馏水溶解，离心，上清液用中空纤维膜超滤，截留分子量6 000以上的药液，浓缩，冷冻干燥得黄芪多糖纯品。
       2.2  黄芪多糖的含量测定方法
       2.2.1  精制黄芪多糖供试液的制备 
       精密称定60℃干燥至恒重的黄芪多糖10 mg，加少量蒸馏水，微热使其全部溶解后，定容至250 ml量瓶中。
       2.2.2  5%苯酚试剂的配制 
       取苯酚100 g，加铝片0.1 g和碳酸氢钠0.05 g，蒸馏，收集182℃馏分，称取此馏分5 g，加水定容至100 ml，置棕色瓶中存冰箱备用。
       2.2.3  苯酚-浓硫酸法最大吸收波长的确定 
       精密吸取2 ml精制黄芪多糖供试液，另精密吸取蒸馏水2 ml作空白对照，分别加入5%苯酚溶液1 ml，混合均匀后快速加入浓硫酸5.0 ml，即刻摇匀，室温静置5 min，沸水浴加热20 min，取出，流水冷至室温，用紫外可见分光光度计在190～900 nm范围内扫描，确定最大吸收波长为490 nm。
       2.2.4  显色方法的优选 
       设计5%苯酚溶液的用量（A）、浓硫酸的用量（B）、水浴的温度（C）、水浴的时间（D）4个因素，每个因素取3个水平，选用L9（34）正交表进行实验。每组实验均精密量取精制黄芪多糖供试液2.0 ml，按正交表中方案显色，测定490 nm波长处的吸收度，以吸收值为评价指标，另同时测定2 h内吸收值的稳定性（每间隔30 min测1次），计算吸收值的RSD。见表1～2。表1  因素水平（略）表2   L9（34）正交实验结果（略）
       由表2可见，以吸收度为主要考察指标，极差R值大小显示各因素作用主次为D>C>A>B，直观分析其最佳显色条件组合为A1B2C1D1。经过方差分析，以吸收度为主要考察指标，A，B，C，D因素对吸收值大小的影响均无显著意义。综合直观分析和方差分析结果，同时考虑操作的简便和条件的易控性，最终确定最佳显色条件为待测溶液2 ml，加入5%苯酚溶液1 ml，混匀，迅速滴加浓硫酸5 ml，摇匀，室温放置5 min，沸水浴加热15 min，取出，流水冷至室温。
       2.2.5  方法学考察
       标准葡萄糖溶液的配制：精密称取105℃干燥至恒重的葡萄糖100 mg于100 ml量瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至刻度，取此溶液10 ml置于100 ml量瓶中，定容至刻度，制成浓度为100 μg·ml-1的标准葡萄糖溶液。
       样品溶液的制备：精密称取黄芪粉末（过30目筛）适量，置于微波提取器中，加80%乙醇，调节功率为900 W，回流提取20 min，滤过，滤液弃去，残渣挥干乙醇，加入蒸馏水250 ml，称重，于900 W，回流提取20 min，放冷，补足重量。精密量取上述溶液1 ml，置200 ml量瓶中，加蒸馏水定容于刻度，即可用于黄芪多糖的测定。
       标准曲线的配制：精密吸取标准葡萄糖溶液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 ml于10 ml具塞试管中，补加蒸馏水至2 ml；另精密吸取蒸馏水2 ml作空白对照，分别加入5%苯酚溶液1  ml，混合均匀后快速加入浓硫酸5.0 ml，即刻摇匀，室温静置20min，于分光光度计490 nm处测定吸收度。以吸收度A为纵坐标，葡萄糖浓度C为横坐标绘制标准曲线，可得回归方程：A=0.014 36C + 0.019 73，r=0.999 5。葡萄糖浓度在10～60 μg/ml范围内，与吸光度呈良好的线性关系。
       精密度实验：分别量取多糖样品溶液2.0 ml，以“标准曲线”项下的操作，对同一样品液连续测定5次。结果表明：采用苯酚-硫酸法测定样品中多糖含量精密度良好，RSD为0.034%，符合含量测定要求。
       重复性实验：精密称取同批黄芪粉末30 g，共6份，按“样品溶液的制备”项下方法操作，制备多糖样品溶液6份，进行含量测定。RSD=0.94%，结果表明本方法重复性良好。
       稳定性实验：取同一样品溶液，显色后间隔一定时间，在490 nm波长处分别测定吸光度。实验结果表明，样品溶液显色后在2.0 h内稳定。
       回收率实验：精密量取已知含量的同批样品溶液6份，每份各1 ml置10 ml具塞试管中，再精密量取1 ml精制多糖供试液加入其中，以“标准曲线”项下的操作，测定回收率。结果回收率平均值为100.3%，RSD=2.049%（n=6）。
       2.2.6  换算因子的测定 
       分别取0.2 ml黄芪多糖供试液，以“标准曲线”项下操作测定A值，计算供试液中葡萄糖含量，按下式计算换算因子 f=W/CD。
       式中：C为供试液中葡萄糖含量（μg/ml）；f为换算因子；
       D为供试液的稀释因素；W为样品重量(μg)
       测得换算因子f= 1.073 1，RSD=0.720 7%(n=3)。
       2.3  微波辅助提取黄芪多糖
       2.3.1  微波功率对黄芪多糖提取的影响精密称取黄芪粉末（过30目筛）30 g，置于微波提取器中，加80%乙醇，调节功率为900 W，回流提取20 min，滤过，滤液弃去，残渣挥干乙醇，加入蒸馏水250 ml，称重，分别于200，400，600，900，1 000 W，回流提取20 min，放冷，补足重量。精密量取上述溶液1 ml，置200 ml量瓶中，加蒸馏水定容于刻度，即可用于黄芪多糖的测定。分别精密量取上述黄芪多糖待测液2.0 ml，按照“标准曲线”项下的操作，测定多糖的含量。结果见表3。表3  微波功率对黄芪多糖提取的影响（略）
       由表3可以看出，在其它实验条件不变的情况下，提取液中黄芪多糖的含量随着微波功率的增大，在600～900 W时出现一个突跃，之后随着功率的增大，多糖含量虽有增大的趋势，但是较为缓和。因此，考虑使用900 W的功率提取黄芪多糖。
       2.3.2  提取时间对黄芪多糖提取的影响精密称取黄芪粉末（过30目筛）30 g，置于微波提取器中，加80%乙醇，调节功率为900 W，回流提取20 min，滤过，滤液弃去，残渣挥干乙醇，加入蒸馏水250 ml，称重，分别于900 W，回流提取5，10，20，30，40 min，放冷，补足重量。精密量取上述溶液1 ml，置200 ml量瓶中，加蒸馏水定容于刻度，即可用于黄芪多糖的测定。分别精密量取上述黄芪多糖待测液2.0 ml，按照“标准曲线”项下的操作，测定多糖的含量。结果见表4。表4  提取时间对黄芪多糖提取的影响（略）
       由表4的数据，可以看出提取30 min后黄芪多糖已基本提取完全。
       综上所述，可以初步确定在液料比不变的情况下，微波辅助提取黄芪多糖的最佳条件是900 W，提取30 min。
       3  讨论
       本实验利用低聚糖、单糖在80%乙醇中易溶解而多糖不溶解的特性，设计黄芪多糖的微波提取工艺。乙醇浓度的稍微不同将造成实验结果的显著差异，因此实验中要严格控制乙醇浓度为80%。
       在黄芪多糖纯化的过程中，本实验采用了三氯乙酸-正丁醇液除去蛋白质，此法蛋白质去除效率高，同时有脱色的作用，但要在低温条件下操作，否则易造成多糖的降解。
       苯酚-硫酸法和蒽醌-浓硫酸法目前被认为是测定糖含量的较理想方法。实验中比较两种方法，结果苯酚-浓硫酸法的准确性较好，灵敏度较高，适用面较广泛，因此选择苯酚-浓硫酸法作为本实验的含量测定方法。其原理为糖类物质在浓硫酸作用下，先水解成单糖分子，并迅速脱水生成糖醛衍生物，糖醛衍生物再与苯酚形成有色化合物，在490 nm处有特征性吸收峰。
       
       目前对黄芪多糖的研究较为充分，黄芪多糖粉针剂已作为抗癌辅助药应用于临床，然而针对黄芪多糖的微波辅助提取研究较少。本实验中比较了加热回流法与微波辅助提取法提取黄芪多糖，发现在黄芪多糖提取率接近的情况下，微波辅助提取法较加热回流提取法的提取时间缩短了将近8倍。实验中使用单因素考察法考察了微波功率与提取时间对黄芪多糖的影响，初步确定了提取工艺的参数。在今后的研究还要使用正交设计法考察各因素协同对黄芪多糖提取的影响，并研究微波辅助提取法对黄芪中其它成分提取的影响。
       【参考文献】
         　　［1］陈阿琴，杨志刚，俞颂东，等. 黄芪多糖药理作用研究进展［J］.中国兽药杂志，2005，39(9)：33..
       
       ［2］段亚丽，谢梅冬. 黄芪化学成分及其有效成分黄芪甲苷含量测定的研究现状［J］.中国兽药杂志，2005，39(3)：35.
       
       ［3］Shao BM，Xu W，Dai H．A study on the immune receptors for polysaccharides from the roots of Astragalus membranaceusm, a Chinese medicinal herb［J］.Biochem Biophys Res Commun，2004，20(4)：1103.