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       【摘要】 
       目的研究五鹤续断中总皂苷的提取分离工艺。方法以提取方法、提取时间和提取溶剂为因素，采用L9（34）进行正交实验。结果超声提取优于索氏提取和微波提取，甲醇优于乙醇和双蒸水。结论用甲醇作为提取溶剂，采用超声波提取1 h，总皂苷提取效率较高。
       【关键词】  五鹤续断 总皂苷 提取工艺 超声波 正交实验
       Procedure Optimization of the Extraction of the Total Saponins in Wu-He Dipsacus asper
       WU Yun
       (Key Laboratory of Biologic Resources Protection and Utilization of Hubei Province, Hubei Institute for Nationalities, Enshi, 445000，China)
       Abstract:ObjectiveTo study the extraction and separation procedure of total saponins from Wu-He Dipsacus asper. MethodsOrthogonal experiment was used with the optimum factors of extracting method, extracting solvent and extracting time, etc respectively.Rusults The results showed that ultrasonic wave extraction method was more efficient than the sorbite extraction method and microwave extraction method. ConclusionThe optimum conditions are as follows：methanol as extracting solvent, ultrasonic wave extraction method and extracting time 1 hour.
       Key wordsWu-He Dipsacus;   Total saponins;   Extraction and separation procedure;  Ultrasonic wave;  Orthogonal experiment
       五鹤续断属于川续断科植物Dipsacus asper，因其产地以湖北鹤峰县、五峰县为主，是川续断中的优质品，资源极其丰富，故在商贸中出现了“五鹤续断”的冠名［1］。现代研究已证明其有效成分主要有皂苷、挥发油类、生物碱类、维生素E和蔗糖等，它具有补肝益肾，续接筋骨，抗骨质疏松，止血安胎等功效，临床上主要用于治疗腰膝酸软、跌打损伤、骨折［2］、腰椎骨质增生、先兆性流产和习惯性流产等［3，4］。
       皂苷作为植物天然活性成分，已早为人们所知。有药理学实验报道，续断的总皂苷提取物是促进骨损伤愈合作用的活性成分［4］。因此，对五鹤续断总皂苷的提取分离工艺进行研究，可为五鹤续断的综合开发与利用提供理论基础。本文以提取方法、提取溶剂和提取时间等为因素，选用L9(34 )正交表［5］进行实验，研究了五鹤续断中总皂苷的提取分离工艺。
       1  方法与器材
       1.1  取样及样品预处理本实验所用材料均采自恩施州鹤峰县走马镇万寺坪道地药材五鹤续断GAP研究及种植基地，采用随机取样的方法，分别取1年生，2年生，3年生和野生的新鲜植株各10株（其根生长3年以后基本上都已木质化，不能作为药用），先用自来水将其根、茎、叶分别清洗干净，再用双蒸水冲洗，切碎后放在105℃的烘箱里杀青30 min～1 h后，于80℃下烘至恒重，将各样品用粉碎机打磨成粉末，过40目筛装于试剂瓶中，贴上标签，贮存于干燥器内备用。
       1.2  仪器与材料
       1.2.1  仪器索氏提取器，756MC-紫外分光光度计，PHS-3C酸度计，SHZ-D循环水式真空泵，电热恒温干燥箱，电子天平（上海天平仪器厂），粉粹机，水浴锅,超声波提取仪，微波提取仪等。
       1.2.2  试剂甲醇，95%的乙醇，乙醚，正丁醇，香草醛，冰醋酸，高氯酸，氢氧化钠，对照品，乙醇，HClO4，浓硫酸，蒽酮，葡萄糖等试剂均为分析纯，提取及试剂用水均为双蒸水。
       1.3   方法
       1.3.1  五鹤续断中总皂苷溶液的制备
       索氏提取：取样品粉末（过40目筛）2.0 g精密称定，置索氏提取器中，加乙醚80 ml，加热回流2 h，弃去乙醚液，药渣挥去乙醚，置于索氏提取器中，加甲醇80 ml，加热提取2 h，取甲醇提取液，挥干，残渣加水15 ml使溶解，水溶液置漏斗中，用水饱和的正丁醇萃取5次，15 ml/次，合并正丁醇萃取液，用1%的氢氧化钠溶液洗涤3次，15 ml/次，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇溶解，定容于25 ml的容量瓶中，待测。
       超声波提取：精密称取样品粉末2.0 g，置15 ml具塞管中，精密加入甲醇10 ml，密塞，超声60 min，放置过夜，精密吸取上清液4 ml于离心管中，加入3倍量乙醚，放置使其完全沉淀，离心60 min，倾去上清液，加10%盐酸10 ml使之溶解，并转入锥形瓶中（少量多次，使完全转入），沸水浴回流2 h，过滤得褐色沉淀于滤纸，使沉淀溶解并过滤于10 ml量瓶中，用甲醇定容，待测。
       微波提取法：精密称取样品粉末2.0 g，置微波罐中，加入甲醇10 ml，密塞，微波提取60 min，放置过夜。之后的提取步骤同超声提取法。
       1.3.2  对照品溶液的配置精密称取经五氧化二磷干燥至恒重的对照品人参皂苷Rb15.0 mg，加甲醇溶解定容至10 ml，制成每毫升0.5 mg的溶液。
       1.3.3  测定波长的选择精密吸取对照品溶液90 ml和供试品溶液20 ml，分别加入干燥的具塞试管中，水浴挥干溶剂，加入新鲜配制的5%香草醛冰醋酸溶液0.2 ml，高氯酸0.8 ml，与60℃恒温水浴加热15 min，取出，流水冷却2 min，加冰醋酸溶液0.2 ml，摇匀，随行试剂空白，在上面扫描的最大吸收波长处测定吸收度A。以吸收度为纵坐标，对照品克数为横坐标，绘制标准曲线，求出线性方程为Y =0.296 6X－0.004 9，R=0.997 1，线性可靠，曲线高度显著。
       1.3.4  总皂苷含量的测定总皂苷含量采用紫外分光光度法进行测定。
       2  结果
       2.1  确定提取五鹤续断中总皂苷的最佳工艺用人工种植的3年生五鹤续断根作为实验材料，综合分析提取方法、提取溶剂和提取时间等各因素的影响程度，本实验采用3因素3水平正交实验L9(34)，以确定提取五鹤续断总皂苷的最佳工艺。实验方案设计如表1。表1  影响五鹤续断总皂苷提取因素实验水平表（略）
       根据因素水平表1，按正交实验L9（34）进行提取，分别按照“1.3.1”项的方法分离纯化总皂苷，用紫外分光光度法测定其吸光度，根据线形方程计算出百分含量。结果见表2。由表2分析可知，各因素对五鹤续断总皂苷的得率影响大小为A>B>C。经直观分析，初步筛选出五鹤续断总皂苷提取工艺的最佳水平组合为A2B3C3，即用甲醇作为提取剂，采用超声波提取3 h，总皂苷提取率最大。但考虑到时间对总皂苷的提取率影响不大，从节约能源和缩短周期两方面考虑，在后续实验中均采用提取时间为1 h。 表2  五鹤续断总皂苷提取正交实验L9（34）结果（略）
       2.2  不同生长期的五鹤续断总皂苷含量的分析用人工种植的不同生长时期五鹤续断根、野生根和续断茎、续断叶作为实验材料，精密称取其干样品各2.0 g，用甲醇超声提取1 h后，按照“1.3.1”的方法进行分离纯化后，用分光光度法测定其含量，其结果见表3。研究表明， 续断根中总皂苷含量较高，其叶片中含量也较高，但其茎没有检测出总皂苷。表3  五鹤续断不同生长时期总生物碱的含量（略）
       3  讨论
       比色法是测定皂苷最常用的一种方法，采用比色法在波长546 nm下对五鹤续断总皂苷进行定量测定，方法简便快捷可行，适于实验室使用。实验中，采用香草醛－高氯酸作为显色剂，显色后，香草醛－高氯酸能与皂甙反应形成特征的紫红色。以5% 香草醛－冰乙酸溶液和0.8 ml 高氯酸溶液为显色剂、显色时间为15 min、显色温度为60℃时，显色灵敏度高，试剂空白溶液色浅，比色体系最稳定。但要注意所用的香草醛－冰乙酸溶液要在用时现配，否则空白值的颜色会加深，影响测定的结果。
       通过对五鹤续断总皂苷提取分离的正交实验分析，确定了五鹤续断总皂苷提取分离的最佳工艺条件，即用甲醇作为提取溶剂，采用超声波提取法，提取时间为1 h，总皂苷的提取效率较高。
       【参考文献】
         　　［1］张万福.湖北“五鹤续断”的地道历史考证及开发前景［J］.湖北民族学院学报(医学报),2002,19(3)：24..
       
       ［2］全国中草药汇编写组. 全国中草药汇编(下册)［M］.北京：人民卫生出版社，2000：135.
       
       ［3］龚晓健，季 晖，王 青，等.川续断总生物碱对妊娠大鼠子宫的抗致痉及抗流产作用［J］.中国药科大学学报,1997,29(6):459.
       
       ［4］纪顺心，吴雪琴，李崇芳.中药续断对大鼠实验性骨损伤愈合作用的观察［J］.中草药, 1997,28(2)：98.
       
       ［5］孙国红, 王学会. 概率论与数理统计学习指南［M］.天津：南开大学出版社，2005.