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       【摘要】 
       目的研究银荆感冒颗粒对乙型流感病毒（B/京防98-96）的抑制作用。方法体外接种乙型流感病毒鼠肺适应株于狗肾细胞(MDCK)，观察银荆感冒颗粒体外抗病毒作用；体内实验①以乙型流感病毒鼠肺适应株滴鼻感染小鼠，观察14 d，计算小鼠存活率及存活天数；体内实验②以乙型流感病毒鼠肺适应株滴鼻感染小鼠，观察肺指数。结果银荆感冒颗粒体外抗乙型流感病毒EC50为3.68 mg/ml。银荆感冒颗粒10 g/kg和20 g/kg剂量组可明显延长乙型流感病毒感染小鼠存活天数，降低死亡率；银荆感冒颗粒20 g/kg剂量组可明显抑制肺指数值，抑制率为36.7%。结论 银荆感冒颗粒对乙型流感病毒有一定的抑制作用。
       【关键词】  银荆感冒颗粒 乙型流感病毒 体内外 抑制
       Effect of Yinjingganmao Granule on Influenza B Virus
       QIU Zhaojuan, ZHU Xuanxuan, NI Wenpeng, YAN Shihai, ZHU Qiong
       (Affiliated Hospital of Nanjing TCM University,Nanjing, Jiangsu 210029, China)
       Abstract：ObjectiveTo investigate the inhibitory effect of Yinjingganmao granule on Influenza B Virus. Methods The inhibitory cytopathic effects(CPE) of Yinjingganmao granule were observed by MDCK cell culture. The experiment in vivo were done by the following two methods：(1) The mice were given Yinjingganmao granule for 7 days and 30 μl Influenza B Virus by nose at sequenti luce. We calculated the survival rate and days of mice 14 days later. (2) The mice were given intragastrically Yinjingganmao granule for 7 days and 30 μl Influenza B Virus by nose at sequenti luce. We calculated the lung index and observed the pathological change. ResultsThe EC50 of Yinjingganmao granule on Influenza B Virus was 3.68mg/ml. The 10g/kg and 20 g/kg groups of Yinjingganmao granule could prolong the survival days and reduce the death rate significantly. The 10g/kg and 20 g/kg groups of Yinjingganmao granule could inhibit the lung index of the infected mice and the inhibition ratio was 31.4 and 29.1% respectively. In addition,  it could also lessen the pathological change.Conclusion：Yinjingganmao granule has inhibitory effect on Influenza B Virus.
       Key wordsYinjingganmao granule;   Influenza B Virus;   In vivo and vitro;   Inhibition
       流行性感冒是上呼吸道传染性极强的病毒感染性疾病，在呼吸系统中发病率占首位，可引起许多并发症，重者可引起死亡。我们运用现代工艺，选用古方银翘散结合临床化裁而制成银荆感冒颗粒，作为本院院内制剂，在临床上取得了良好疗效。为了探索该颗粒剂治疗流行性感冒的机制，我们选择与呼吸道有关的乙型流感病毒，以该病毒感染小鼠为药物评价模型，通过感染小鼠存活率、存活天数、肺指数值与肺病理变化为指标来评价药效，同时结合体外实验，来观察银荆感冒颗粒对乙型流感病毒引起的细胞病变的作用。
       1  材料与仪器
       1.1  药物及试剂银荆感冒颗粒，江苏省中医院药剂科提供，批号050424；利巴韦林注射液，四川美大康药业股份有限公司，批号050316；RPMI Medium 1640，GIBCO公司；胰蛋白酶，上海伯奥生物技术有限公司，批号020602；HEPES，江苏科威技术服务有限公司，批号H3375；磷酸氢二钠，南京化学试剂厂，批号051207；磷酸二氢钾，广西西陇化工厂， 批号041119；碳酸氢钠，上海虹光化工厂，批号050622；新生牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司，批号050827；青霉素，山东鲁抗医药股份有限公司，批号8040613；链霉素，大连美罗大药厂，批号040707；乙醚,南京试剂厂,批号050628。
       1.2 仪器
       CO2培养箱（BB16）, Beracus公司；倒置显微镜（XSZ-D2），重庆光学仪器厂；微孔滤器，上海医药工业研究院；细胞培养板，丹麦NUNC公司；净化工作台（SW-CJ-IF）苏州安泰空气技术有限公司；FA1004型电子分析天平，上海精科天平厂。
       1.3  病毒株及细胞株   
       乙型流感病毒 B/京防98-96，购自中国预防医学科学院病毒所，由江苏省中医院临床研究所药理实验室传代后-70℃低温冰箱保存备用；狗肾细胞(MDCK)，购自上海细胞所。
       1.4  动物ICR小鼠，♀♂兼用，体重16～24 g，由南京青龙山动物饲养厂提供，合格证号：SCZK（苏）2001-0018。
       2  方法
       2.1  银荆感冒颗粒体外对乙型流感病毒的作用
       2.1.1  MDCK细胞培养新购置的MDCK细胞，用0.25%的胰酶消化，然后加入含血清培养液适量，轻轻吹打均匀，按1∶3比例进行分瓶传代。实验前则接细胞于96孔培养板中，培养24 h后，用于实验。
       2.1.2  病毒毒力测定将冻存的病毒液快速冻融后，按10倍稀释法稀释成10-1～10-9的不同稀释液，接种到MDCK细胞培养板中，每个浓度4个孔，每孔接种150 μl病毒液，于5%CO2，37℃静置培养，同时设正常细胞对照，4个复孔，观察细胞病变情况，以CPE不再进展时,按Reed-Muench氏法［1］计算病毒滴度，即该病毒的TCID50。CPE程度：－，无细胞病变；+，25%细胞病变；＋＋，50%细胞病变；＋＋＋，75%细胞病变；＋＋＋＋，100%细胞病变。
       2.1.3  银荆感冒颗粒最大无毒浓度实验银荆感冒颗粒（浸膏），每毫升相当于4.9 g药材，首先将原浸膏稀释成1 g/ml，再用完全培养液稀释成100 mg/ml，最后用完全培养液将其分别稀释成80，40，20，10，5，2.5 mg/ml的不同浓度加入长成单层MDCK细胞的96孔培养板中，每个浓度4个复孔，每孔150 μl同时设立正常细胞对照组，置培养箱中培养，观察细胞的生长情况，观察病变情况，以不出现细胞变暗、变圆、融合、脱落等病变的最大药物浓度为该药物的无毒性浓度。
       2.1.4  银荆感冒颗粒TC50测定根据最大无毒浓度实验结果，将银荆感冒颗粒稀释成不同浓度，加入长成单层MDCK细胞的96孔板，每个浓度4个复孔，150 μl/孔，同时设立正常的细胞对照组，置培养箱中培养，观察细胞的生长情况，观察病变情况，采用孙氏综合法［2］计算该药物对细胞的TC50［2］。CPE程度：－，无细胞病变；+，25%细胞病变；＋＋，50%细胞病变；＋＋＋，75%细胞病变；＋＋＋＋，100%细胞病变。
       2.1.5  银荆感冒颗粒对乙型流感病毒的作用已长成单层的细胞接种剂量为10 TCID50的病毒，置37℃，5%CO2温箱孵育2 h，弃去含病毒维持液，更换含不同浓度药物的维持液，置培养箱内培养。每天观察细胞形态，连续观察3 d，记录CPE程度，同时设立正常细胞对照组、病毒对照组各四孔，采用孙氏综合法计算药物半数有效浓度(EC50)和治疗指数(TI)。治疗指数(TI)=TC50/EC50。CPE程度：－，无细胞病变；+，25%细胞病变；＋＋，50%细胞病变；＋＋＋，75%细胞病变；＋＋＋＋，100%细胞病变。
       2.2  银荆感冒颗粒体内对乙型流感病毒的作用
       2.2.1  病毒感染小鼠半数致死量（LD50）测定方法见参考文献［1］。
       2.2.2  银荆感冒颗粒对乙型流感病毒感染小鼠死亡的保护作用取ICR小鼠120只，体重13～16 g，♀♂各半，随机分6组，每组20只：①空白对照组，等量生理盐水；②模型组，等量生理盐水；③利巴韦林组，75 mg/kg；④银荆感冒颗粒Ⅰ组，5 g/kg；⑤银荆感冒颗粒Ⅱ组，10 g/kg；⑥银荆感冒颗粒Ⅲ组，20 g/kg。以上各组均灌胃给药，给药容量10 ml/kg，1次/d×5 d 。于给药第2天各小鼠（除空白对照组外）在乙醚麻醉下，以血凝试验640以上的尿囊液给小鼠滴鼻感染，每鼠30 μl（20个LD50致死量）观察感染后发病及死亡情况，每日记录动物的死亡情况，连续2周。
       2.2.3  银荆感冒颗粒对乙型流感病毒感染小鼠肺指数取ICR小鼠60只，体重13～16 g，♀♂各半，随机分6组，每组10只：①正常组，等量生理盐水； ②病毒对照组，等量生理盐水；③利巴韦林组，75 mg/kg；④银荆感冒颗粒Ⅰ组，5 g/kg；⑤银荆感冒颗粒Ⅱ组，10 g/kg；⑥银荆感冒颗粒Ⅲ组，20 g/kg；以上各组动物均灌胃给药，灌胃容量10 ml/kg，1次/d×5 d。于给药第2天各组动物（除空白对照组外）在乙醚麻醉下，用增毒3次尿囊液滴鼻感染小鼠，每鼠30 μl（20个LD50致死量），实验前禁食不禁水，末次给药后，实验当日各组小鼠称重，脱颈椎处死取全肺称重，计算各鼠肺指数及肺指数抑制率，比较各组间差异。肺指数（%）=小鼠肺重（g）/小鼠体重（g）×100%；肺指数抑制率（%）=对照组平均肺指数-实验组平均肺指数/对照组平均肺指数×100%。
       2.3  统计方法数据处理运用SPSS13.0软件完成，组间比较采用单因素方差分析。
       3  结果
       3.1  银荆感冒颗粒体外对乙型流感病毒的作用
       3.1.1  病毒毒力测定结果为了解乙型流感病毒在MDCK细胞中的毒力情况, 确定体外抗病毒药效学实验中病毒的攻击量。根据所得数据，采用Reed-Muench法计算TCID50为10-3.67。
       3.1.2  银荆感冒颗粒毒性实验测定结果为了解银荆感冒颗粒在MDCK细胞中的毒性作用,确定实验中药物剂量,。根据所得数据, 银荆感冒颗粒最大无毒浓度为20 mg/ml；采用孙氏综合法计算TC50为26.94 mg/ml。
       3.1.3  银荆感冒颗粒体外对乙型流感病毒作用有良好的抑制作用，其EC50为3.68 mg/ml。TI为8.31。
       3.2  银荆感冒颗粒体内对乙型流感病毒的作用
       3.2.1  病毒感染小鼠半数致死量（LD50）测定为了了解乙型流感病毒感染小鼠的死亡情况，确定体内实验乙型流感病毒感染小鼠的量。按孙氏综合法计算LD50是10-2.23。
       3.2.2  银荆感冒颗粒对乙型流感病毒感染小鼠死亡的保护作用结果见表1。表1  银荆感冒颗粒对乙型流感病毒感染小鼠死亡的保护作用(略)
       实验结果提示：银荆感冒颗粒10 g/kg和20 g/kg剂量组可明显减少乙型流感病毒感染小鼠的死亡率，并可延长存活天数，与模型组比较具有显著性差异，提示银荆感冒颗粒具有抗乙型流感病毒的作用。
       3.2.3  银荆感冒颗粒对乙型流感病毒感染小鼠肺指数的影响结果见表2。表2  银荆感冒颗粒对乙型流感病毒感染小鼠肺指数的影响（略）
       实验结果提示:银荆感冒颗粒20 g/kg剂量组对乙型流感感染小鼠肺指数抑制率为36.7%，与模型比较具有显著性差异。提示：银荆感冒颗粒可减轻乙型流感病毒对肺部的感染，具有抗乙型流感病毒的作用。
       4  讨论
       流行性感冒由流感病毒引起，目前，国际上防治流感的方法是接种减毒活疫苗和使用化学药物治疗，但由于流感病毒容易发生抗原变异，使疫苗保护作用效果受到一定限制，而使用的化学药物又有较大的不良反应，因此到目前为止还没有有效防治流感的方法［3］。中医认为流行性感冒是外感六淫，时行病毒所致。以风为主因，风为六淫之首，但在不同季节，往往与其它当令之时气相合而伤人。一般以风热为多见，银荆感冒颗粒由金银花、连翘、荆芥、板蓝根，防风和薄荷组成，是银翘散结合临床经验化裁而成，方中金银花味甘，性寒，连翘味苦，性微寒，甘苦相合为君药，既有辛凉透邪清热之效，又有芳香辟秽解毒之功；荆芥味辛，性温，助君药辛开皮毛而散邪，板蓝根苦寒助君药清热解毒，共为臣药；防风、薄荷加强辛散泄热。对风热感冒发热、咽痛、周身酸痛、咳嗽等症有良好的治疗作用。我们通过体内外实验初步证实了银荆感冒颗粒确有抗乙型流感病毒的作用。
       【参考文献】
         　　［1］杜平.医用实验病毒学［M］.北京：人民军医出版社，1985：80，107.
       
       ［2］陈奇.中药药理研究方法学［M］.北京：人民卫生出版社，2006：113.
       
       ［3］Luscher-Mattli M. Influenza chemotherapy: a review of the present state of art and of new drugs in development［J］. Arch Virol,2000，145：2233.