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       【摘要】 
       目的探讨银杏叶提取物（EGb）诱导大鼠主动脉平滑肌细胞（SMC）中血红素氧合酶-1(HO-1)表达的量效关系，并初步探讨EGb诱导HO-1表达的分子机制。方法复苏并传代培养大鼠主动脉SMC，分组实验，分别采用0，50，100，200，400 μg/ml 5个不同浓度的EGb以及200 μg/ml EGb加放线菌素D（ActD）孵育SMC 8 h，Western blot法检测HO-1蛋白，以HO-1条带灰度值代表HO-1的表达量。结果不加EGb的对照组中HO-1蛋白仅有微量基础表达，加用EGb各组中HO-1蛋白的表达随EGb浓度的增加而增加（P＜0.05），在EGb浓度为200 μg/ml时达到峰值，随后则有所下降。加用ActD能显著抑制EGb所诱导的HO-1蛋白表达（P＜0.05）。结论EGb能够诱导大鼠主动脉SMC中HO-1表达，且这种表达在一定范围内具有量效关系；EGb诱导HO-1表达有赖于基因重新转录。
       【关键词】  银杏叶提取物 大鼠 主动脉平滑肌细胞 血红素氧合酶-1
       Experimental Study on the Heme Oxygenase-1 Expression Induced by the Extract of Gingko biloba in Rat Aorta Smooth Muscle Cells
       WANG Hongxia, YANG Xiaoyu, WEI Zongde, HUANG Weiyi
       (The affiliated Hospital of Luzhou Medical College,Luzhou,Sichuan,646000,China)
       Abstract：ObjectiveTo explore the dose-effect relationship and the molecular mechanism of the heme oxygenase-1(HO-1) expression induced by the extract of Gingko biloba(EGb) in rat aorta smooth muscle cells (SMC).MethodsThe SMC was revived,passage cultivated and divided into different groups.The cells in each group were incubated with 5 concentrations of EGb such as 0，50，100，200，400 μg/ml and EGb 200 μg/ml+ActD4 μm respectively. The incubation lasted for 8 hours,then Western blot was applied to analyze HO-1 protein expression.ResultsThere was only basal microamount expression in the group without EGb. EGb significantly induced the expression of HO-1 in SMC and the expression increased with the increase of EGb concentration (P＜0.05),it reached the peak amplitude under the condition of EGb 200 μg/ml,then desceded.EGb-induced HO-1 expression was significantly inhibited by ActD.ConclusionEGb can induce HO-1 expression in rat aorta SMC and the expression has a dose-dependent feature under a limited EGb concentration range.EGb-induce HO-1 protein expression depends on HO-1 genetic retranscription.
       Key words：Extract of gingko biloba；  Rat;  Smooth muscle cell;  Heme oxygenase-1
       动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）是危害人类健康的严重心血管疾病，近年来其发病率和死亡率更是不断上升，对其防治方法的研究一直倍受关注。已知氧化应激损伤是致AS的核心环节，抗氧化应激已成为防治AS的有效途径之一。血红素氧合酶-1（Heme oxygenase-1,HO-1）是血红素氧合酶的诱导型，在应对氧化应激损伤中发挥着不可或缺的作用，逐渐积累的证据显示，HO-1系统在抗AS中起着重要作用［1］。银杏叶提取物（Extract of Gingko biloba,EGb）是传统中药银杏中的一种标准提取物，主要包含黄酮类和萜类内酯化合物，有抑制AS斑块形成和抗低密度脂蛋白体外氧化修饰等作用，是临床治疗AS的有效药物，但EGb能否诱导HO-1表达并籍以发挥抗AS作用尚不得而知。本文拟对EGb诱导体外培养的大鼠主动脉SMC中HO-1表达作用作初步探讨。
       1  材料与方法
       1.1  材料
       大鼠主动脉平滑肌细胞株（Smooth muscle cell,SMC）第3代由四川大学华西医院传染科侯洁博士赠送；细胞培养试剂包括DMEM/F12、胎牛血清、胰蛋白酶、二甲基亚砜等购于美国Gibco公司；银杏叶提取物（金纳多注射液）购于德国Willmar Schwabe药厂；放线菌素D（ActD）购于Sigma生物试剂公司；免疫试剂：一抗（小鼠抗大鼠HO-1单克隆抗体）、二抗（辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG抗体）购于Stressgen Biotech公司；Westren Blot检测试剂购于Sigma生物试剂公司。
       1.2 方法
       复苏大鼠主动脉SMC株第3代并传代培养至第6代，再以每孔4×105个细胞转至6孔板中继续培养；当SMC生长密度达到80%左右时使用含1%胎牛血清的培养基预处理24 h使细胞生长同步化。分组实验，每组5个复孔：①EGb诱导实验：分为A，B，C，D，E组，分别加入0，50，100，200，400 μg/ml 5种浓度的EGb孵育细胞8 h。②ActD阻断实验：分为对照组、EGb组及EGb+ActD组，分别加用等浓度的空白液、EGb 200 μg/ml及EGb 200 μg/ml+ActD 4 μm，孵育细胞8 h。随后收集细胞，加入细胞裂解液300 μl，冰上充分振荡裂解1 h，高速低温离心取上清液提取蛋白。BCA法测蛋白含量后，样品蛋白和上样缓冲液按3∶1的比例混匀后，沸水浴中煮沸5 min使蛋白变性，短暂离心去除沉淀；制备聚丙烯酰胺凝胶，用微量加样器将已经处理好的样品以每孔30 μg上样，并用β-actin（分子量42KD）作为内参校正上样量，电压200v，电流50 mA，电脉2 h；考马斯亮蓝染色观察蛋白条带；电转移1 h后用脱脂奶粉封闭PVDF膜；TBST洗膜后加入抗体（一抗稀释度1∶5000，室温下2 h；二抗稀释度1∶10 000，室温下1 h）；ECL法免疫荧光显像。用Image-Pro Plus图像分析软件对HO-1条带进行分析，以HO-1条灰度值代表HO-1的表达量。
       1.3  统计学分析
       实验所得数据用±s表示，采用F+q检验，应用SPSS 13.0软件进行统计分析。
       2  结果
       2.1  EGb诱导实验各组的HO-1蛋白表达对照组中HO-1蛋白电泳条带影随EGb浓度增加而加深，在EGb浓度为200 μg/ml时条带显影最深，当EGb浓度增至400 μg/ml时，HO-1蛋白条带显影反而转浅，详见图1。灰度值分析显示：对照组中HO-1蛋白仅有微量基础表达，50，100，200 μg/ml组HO-1蛋白表达逐渐增加，在EGb 200 μg/ml HO-1蛋白表达达到峰值，随后呈下降趋势，详见表1。表1  EGb诱导实验组蛋白印迹图像分析结果(略)
       2.2  ActD阻断实验各组的HO-1蛋白表达3组中HO-1蛋白条带显影程度各有不同，EGb组条带明显加深，而EGb+ActD组条带明显变浅，详见图2。灰度值分析：EGb组诱导的HO-1表达量显著高于对照组，EGb+ActD组HO-1蛋白表达受抑，明显低于EGb组，详见表2。表2  ActD阻断实验组蛋白印迹图像分析结果(略)
       3  讨论
       HO-1即热休克蛋白32（HSP32），分子量为32kD，是细胞内的一种重要的抗氧化酶。HO-1连同其酶解产物胆红素、CO一起组成了机体重要的保护系统，广泛参与抗氧化、抗炎、抗细胞增殖、调节血管张力，参与细胞内信号传递等重要作用［2，3］。用免疫组化染色和原位杂交的方法研究已证明，在人和实验动物AS斑块巨噬细胞、肥大细胞和内皮细胞内，HO-1是高表达的，这种适应性的高表达被认为具有抗AS的积极意义［4］。研究显示，增加HO-1表达能有效抑制AS的发生，反之，若用药物阻断HO-1活性则可使AS病变程度显著加重，表明HO-1系统在防止AS中起着重要作用，故合理调控HO-1表达可望成为有效防治AS新途径。HO-1本质上是一种应激酶，具有高度可诱导性，但因HO-1基因启动区内存在着许多特殊的调控位点，诱导HO-1表达的信号通路非常复杂。众多致氧化应激损伤的因素如H2O2、重金属离子、内毒素、OX-LDL等均是通过改变细胞内氧化-还原状态来诱导HO-1的表达。一些生物黄酮在近年被证明是无细胞毒性的HO-1诱导剂，有着光明的临床应用前景。EGb是传统中药银杏中的一种标准提取物，主要成分为黄酮类和萜类内酯化合物，近来揭示，EGb是一个天然的HO-1增效药，EGb的抗氧化作用可能更主要通过诱导HO-1这一强大的细胞内源性抗氧化酶的表达实现的。已经发现EGb可以诱导大鼠睾丸中HO-1表达；另有报道，EGb可以增强HO-1活性从而抑制脂质过氧化及阻止AS斑块的形成［5，6］。但是，有关对EGb诱导VSMC中HO-1的表达的研究却比较缺乏，为填补这方面研究的空白，我们采用体外培养的大鼠主动脉SMC作为研究对象，结果显示EGb确实具有诱导VSMC表达HO-1的潜能，并且这种诱导表达在一定范围内具有量效关系，即随EGb浓度增加HO-1蛋白表达也增加，且在EGb浓度达200 μg/ml时，诱导HO-1蛋白表达达到峰值，随后略有下降，其下降可能与其诱导机制中某些转录因子达到饱和有关，也可能是HO-1蛋白过度表达后出现了某种形式的反馈抑制。
       本文结果还显示，EGb诱导大鼠SMC中HO-1的表达可以被RNA转录酶抑制剂ActD阻断，表明其表达是依赖于HO-1基因的重新转录。之前也有研究表明，同样是生物黄酮的姜黄素（curcumine）诱导人肾脏近端小管细胞HO-1蛋白的表达也是依赖于基因的重新转录，且这一过程经由P38MAPK及Nrf2/ARE［7,8］等介导的细胞内信号转导途径。EGb诱导HO-1基因转录与表达的具体细胞内信号转导途径是否与之相似有待进一步研究。
       已知动脉SMC是AS是病理过程的重要参与者。在致病因素的作用下，SMC经内弹力膜迁入内膜，并发生增生、表型转化、分泌细胞因子和合成细胞外基质，同时，经表面受体介导吞噬脂质，导致脂纹和纤维斑块的产生。研究发现，SMC内HO-1高表达能对细胞本身的增殖迁移等产生抑制作用，有助于拮抗AS［9，10］。因此，我们的实验结果将为进一步探讨EGb防治AS的作用与机制奠定基础。
       【参考文献】
         　　［1］Wu BJ,Kathir K,Witting PK,et al.Antioxidants protect from atherosclerosis by a heme oxgenase-1 pathway that is independent of free radical scavenging［J］.J Exp Med,2006,203(4):1117.
       
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       ［3］Schaer CA,Schoedon G,Imhof A,et al.Constitutive endocytosis of CD163 mediates hemoglobin-heme uptake and determines the noninflammatory and protective transcriptional response of macrophages to hemoglobin［J］.Circ Res,2006,99(9):943.
       
       ［4］Miyoshi T,Tian J,Matsumoto AH,et al.Differential response of vascular smooth muscle cells to oxidized LDL in mouse strains with different atherosclerosis susceptibility ［J］.Atherosclerosis,2006,189(1):99.
       
       ［5］Li K,Yao P,Zhou SL,et al.Protective effects of extract of Ginkgo biloba against ethanol-induced oxidative injury in rat testes［J］.Wei Sheng Yan Jiu ,2005,34(5):559.
       
       ［6］Hoekstra KA,Godin DV,Cheng KM.Protective role of heme oxygenase in the blood vessel wall during atherogenesis［J］.Biochem Cell Biol,2004,82(3):351.
       
       ［7］Hill-Kapturczar N,Thamilselvan V,Thamilselvan v,et al.Mechanism of heme oxygenase-1 gene induction by curcumin in renal proximal tubule cells［J］.Am J Physiol Renal Physiol ,2001,281(5):851.
       
       ［8］Rushworth SA,Ogborne RM,Charalambos CA,et al.Role of protein Kinase C delta in curcumin-induced antioxidant response alement-mediated gene expression in human monocytes［J］.Biochem Biophy Res Commun,2006,341(4):1007.
       
       ［9］Choi BM,Kim YM,Jeong YR,et al.Induction of heme oxygenase-1 is involved in anti-proliferative effects of paclitaxel on rat vascular smooth muscle cell［J］.Biochem Biophys Res Commun,2004,321(1):132.
       
       ［10］LI W,Tanaka K,Morika K,et al.Thymidine phosphorylase gene transfer inhibis vascular smooth muscle cell proliferation by upregulating hime oxygenase-1 and p27KIP1［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol,2005(7):1370.