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       【摘要】 
       目的研究竹节人参蛋白质提取最佳生产工艺。方法采用单因素和L9（34）正交实验，以竹节人参蛋白质得率为指标，考察了氢氧化钠溶液的浓度、用量、提取时间和提取次数对提取效果的影响。结果氢氧化钠浓度为0.15 mol/L，用量为样品体积的20倍，提取时间1.5 h，提取 3 次为最佳工艺。结论 该工艺合理，重复性好，可为竹节蛋白质提取工艺的确定提供实验依据。
       【关键词】  竹节人参 蛋白质 单因素递变 正交实验 工艺条件
       Study on Extraction Process of Protein in Panax japonicus
       XIANG Dongshan, ZHAI Kun
       （1. College of Chemistry and Environment Engineering，Hubei Institute for Nationalities，Enshi, 445000，China;2. Key Laboratory of Biological Resources Protection and Utilization of Hubei Province, Research Institute of Biological Technology of Hubei Institutes for Nationalities，Enshi, 445000，China）
       Abstract:ObjectiveTo study the extraction process of protein from panax japonicus.MethodsUse orthogonal design L9（34）,and take the protein rate as the index，definite the best condition of protein process.ResultsThe best process condition was 0.15 mol/L Sodium hydroxide, 20 times amount of samples, the extraction time was 1.5 hours, had extracted 3 times.ConclusionThis process is the best and it can be used for extraction of Panax japonicus protein.
       Key words:Panax japonicus;  Protein;   Single factor change;   Orthogonal experiment;   Craft conditions
       竹节人参属五加科植物，别名竹节三七、竹节参、白三七、北三七、大叶三七［1～3］。具有滋补强壮、散瘀止痛、止血祛痰等功能，兼具我国北药人参和南药三七之功效，在民间有“草药之王”的美誉，属我国特有珍贵中药材资源。
       湖北恩施是世界第一高硒地区［4］，生长于这一地区的竹节人参由于其富含硒而药效独特，疗效显著［5］，现已进行大规模的种植，资源十分丰富。现代药理学研究表明，竹节人参主要活性物质为皂苷类、多糖、氨基酸及少量的挥发性油等［6］。目前，在对竹节人参活性成分进行提取的同时，浪费了大量竹节人参的含硒有效成分。为了充分利用宝贵的富硒竹节人参资源，笔者选择了生长在高硒地区的竹节人参为研究对象，系统研究了竹节人参中各活性成分及有效成分的提取工艺，为综合利用竹节人参提供理论依据。本文旨在以超声提取皂苷后的残渣为原料，通过单因素和正交实验，探讨残渣中蛋白质最佳提取工艺。
       1  器材与方法
       1.1  材料
       竹节人参由湖北省中药材研究所提供，为家种4年生的竹节人参根。在以甲醇为溶剂，超声提取竹节人参皂苷后的残渣为本实验的原料。
       1.2  仪器
       AVANTI30高速冷冻离心机(美国贝克曼公司)； S53/54全波长分光光度计。
       1.3  实验方案设计
       1.3.1  溶剂的选择控制样品与提取溶剂的体积约比为1∶20，分别用水，0.1 mol/L氯化钠溶液，0.1 mol/L的盐酸及0.1 mol/L氢氧化钠溶液作为溶剂于常温下进行提取，以蛋白质的得率为指标，选择最佳溶剂。
       1.3.2  单因素实验本实验以溶剂的浓度、溶剂用量、提取时间及提取次数作为影响竹节人参蛋白质得率的单因素，设置各因素不同的水平，找出不同因素对蛋白质得率的影响规律。
       1.3.3  正交实验以单因素实验的结果为参考，进行溶剂的浓度、溶剂用量、提取时间及提取次数4因素3水平正交实验设计方案，因素水平表（见表1）。以蛋白质的得率为指标，通过L9（34）正交实验确定最佳的提取条件。表1  正交设计因素水平（略）
       1.4  样品处理提取竹节人参皂苷的残渣置鼓风干燥箱中60℃下烘干，密封置于干燥器中备用。
       1.5  蛋白质的提取与分离分别用水、0.1 mol/L氯化钠溶液、0.1 mol/L的盐酸及0.1 mol/L氢氧化钠溶液作为溶剂，对样品中的蛋白质进行提取，得到相应的溶液即为水溶蛋白质、盐溶蛋白质、酸溶蛋白质及碱溶蛋白质。然后在水溶蛋白、盐溶蛋白、酸溶蛋白及碱溶蛋白的提取液中加入硫酸铵至饱和，4℃静置过夜，离心，取沉淀透析至透析液中加饱和氯化钡无沉淀生成时，再分别用蒸馏水、0.1 mol/L氯化钠、0.1 mol/L盐酸及0.1 mol/L氢氧化钠溶液充分溶解后定容，备用。
       1.6  蛋白质得率的计算蛋白质得率η=100×(m1 /m2)，其中m1为从样品中所提取出的蛋白质的质量，m2为样品的质量。
       1.7  测定方法蛋白质含量测定用考马斯亮蓝G-250显色，595 nm测吸光度值，用牛血清蛋白制作标准曲线，曲线回归方程Y=507.13X -0.076 4，相关性系数r=0.998 6。
       2  结果
       2.1  溶剂的选择在选定的条件下，用水、0.1 mol/L氯化钠溶液、0.1 mol/L的盐酸及0.1 mol/L氢氧化钠溶液作为提取溶剂，分别从样品中提取蛋白质，然后测定并计算出蛋白质的得率，其结果如表2所示。由表2可知，用氢氧化钠作提取溶剂，蛋白质的得率都明显地高于其它提取溶剂，因此本实验选择氢氧化钠作为提取溶剂。表2  不同溶剂对竹节人参蛋白质得率的影响（略）
       2.2  单因素实验
       2.2.1  氢氧化钠溶液浓度对样品中蛋白质提取效果的影响为了研究氢氧化钠溶液的浓度对蛋白质提取效果的影响，本实验设置了4个浓度梯度，其浓度分别为0.05，0.1，0.15，0.2 mol/L。用不同浓度的氢氧化钠溶液提取样品中的蛋白质，用上述方法计算蛋白质的得率。提取条件为20倍体积的氢氧化钠溶液常温提取，每个样品提取2次，2 h/次，其结果见图1。由图1可知，随着氢氧化钠浓度的升高，蛋白质的得率增加，但浓度升高到一定程度时，蛋白质的得率反而有所下降，这可能是由于氧氧化钠溶液的浓度过高使部分蛋白质发生了变性。本实验结果以0.15 mol/L的氢氧化钠溶液为最佳。
       2.2.2  氢氧化钠溶液用量对样品蛋白质提取效果的影响为了研究氢氧化钠溶液的用量对蛋白质提取效果的影响，本实验设置了4个不同的氢氧化钠的用量，分别为样品体积的10，15，20，25倍。提取条件为0.1 mol/L的氢氧化钠溶液常温提取，每个样品提取2次，2 h/次。按上述方法计算蛋白质的得率，其结果见图2。由图2可知，随着氢氧化钠体积的增加，蛋白质的得率也增加，当体积增大到20倍后，再增加溶液的体积时，蛋白质的得率变化很小，结合成本考虑，20倍体积的氢氧化钠溶液为最佳。
       2.2.3  提取时间对样品蛋白质提取效果的影响为了研究提取时间对蛋白质提取效果的影响，本实验设置了4个不同的提取时间，分别为提取0.5，1，2 ，3 h/次。提取条件为20倍体积0.1 mol/L的氢氧化钠溶液常温提取，每个样品提取2次。然后用同样的方法计算蛋白质的得率，其结果见图3。由图3可知，随着提取时间的增加，蛋白质的得率增加，当提取时间增加到2 h后，蛋白质得率增加的弧度很小，从时间和能耗方面考虑，以提取2 h/次为宜。
       2.2.4  提取次数对样品蛋白质提取效果的影响为了研究提取次数对样品蛋白质提取效果的影响，本实验在提取次数上设置了4个不同处理，分别为1，2，3，4次。提取条件为20倍体积0.1 mol/L的氢氧化钠溶液常温提取，提取2 h/次。然后用同样的方法计算蛋白质的得率，其结果见图4。由图4可知，随着提取次数的增加，蛋白质的得率增大，但提取次数达到2次后，再增加提取次数，蛋白质的得率增加很小，从成本方面考虑，以提取2次为宜。
       2.3  正交实验为了研究不同因素共同作用对竹节人参蛋白质提取效果的影响，采用L9（34）正交表对样品中蛋白质进行提取，以蛋白质的得率为指标，进行实验优化，确定最佳的提取条件。结果及方差分析见表3及表4。表3  样品中蛋白质提取正交实验表及结果（略）表4  样品中蛋白质提取正交实验的方差分析（略）
       由表3中的极差可知，影响样品中蛋白质得率的各因素中，其主次顺序依次为D > A > B > C，即提取次数>氢氧化钠的浓度> 氢氧化钠的用量>提取时间。表4的方差分析表明，提取次数对蛋白质的得率具有显著的影响，其它各因素对蛋白质得率的影响未达到显著水平。
       本实验结果表明，A3B2C1D3组合提取蛋白质的效果最好。即对样品中蛋白质的最佳提取条件为：氢氧化钠的浓度为0.15 mol/L，用量为样品体积的20倍，提取时间为1.5 h，提取次数为3次。
       3  讨论
       通过提取溶剂的选择，确定了用氢氧化钠溶液进行提取。
       通过单因素实验，得到了各因素在不同水平下的较佳数值，其中提取次数对蛋白质得率影响较大。
       
       通过正交实验及方差分析，确定了样品中蛋白质提取的最佳工艺条件为：氢氧化钠的浓度为0.15 mol/L，用量为样品体积的20倍，提取时间为1.5 h，提取次数为3次。
       
       本文旨在以超声提取皂苷后的残渣为原料，通过单因素和正交实验探讨残渣中蛋白质的最佳提取工艺。对于竹节人参主要活性物质皂苷及多糖的提取工艺已另文发表。
       【参考文献】
         　　［1］范崔生.中药采收鉴别应用全书［M］.南昌：江西科技出版社，1995：347.
       
       ［2］湖北省恩施地区中草药研究组，恩施中草药手册［M］.1970：308，470.
       
       ［3］罗献瑞. 实用中草药彩色图集(二)，第3版［M］.广州：广东科技出版社，2003：230.
       
       ［4］刘培棣.硒资源及其综合开发利用［M］.北京：中国科学技术出版社，1993：23.
       
       ［5］肖本见，陈国栋，谭志鑫，等.竹节人参对脑缺血大鼠兴奋性氨基酸的影响［J］.中药药理与临床，2005，21（6）：36.
       
       ［6］左锐，袁丁.竹节人参化学成分和药理活性研究进展［J］.时珍国医国药，2005，16（9）：838.