文章标题 全文   多个检索词，请用空格间隔。

       【摘要】 
       目的探讨人参多糖对冷应激大鼠生殖功能的影响，研究大鼠睾丸组织雄激素受体mRNA表达与血浆睾酮变化及人参多糖的调节作用。方法采用大鼠雄激素受体（AR）cDNA探针斑点杂交法检测雄激素受体mRNA表达强度，血浆睾酮含量测定采用放射免疫分析法。结果对照组睾酮含量为（10.93±1.44） nmol·L-1，冷应激实验组为（6.06±1.78） nmol·L-1，冷应激人参多糖实验组为（8.01±1.38） nmol·L-1。实验组与对照组比较，差异显著（P＜0.05）。Dot – blot杂交结果：冷应激实验组明显弱于对照组，冷应激加人参多糖实验组弱于对照组但强于冷应激实验组。结论冷应激使睾酮水平下降，雄激素受体mRNA表达信号减弱，人参多糖可促进冷应激条件下的睾酮生成，加强雄激素受体mRNA表达。
       【关键词】  冷应激 人参多糖 斑点杂交 雄激素受体
       Study on the Changes of Rat Testis Androgen Receptor mRNA Expression and Plasma Testosterone after Cold Stress
       WANG Hongjun, FENG Li, CHU Zheng, YU Ning, YANG Qing, ZHANG Zhiqiang, WANG Liqiang1,WU Yimin
       1.Centre of Disease Prevent and Control of Shenyang Command, Shenyang, 110034,China;
       2.General Hospital of Shenyang Military District,Shenyang 110034,China
       Abstract：Objective To study the effect of ginseng polysugar on the mRNA expression of testis tissue androgen receptor and plasma testosterone change after cold stress.MethodsRats were divided into control group,cold stress experiment group and cold stress ginseng polysugar group, testis tissue androgen receptor mRNA expression was determined by rat androgen receptor cDNA probe dot blotting. Testosterone was determined by radioimmunoassay kit(RIA kit). ResultsThe content of testosterone（nmol/L） was 10.93±1.44 in control group, 6.06±1.78 in cold stress experiment group, 8.01±1.38 in cold stress ginseng polysugar group. There was a significant synthesis difference between cold stress group and control group(P＜0.05). Dot – blot： the mRNA expression of androgen recepter in cold stress group was weaker than that in control group, cold stress ginseng polysugar group was more than that in cold stress group. ConclusionTestosterone has identical change with androgen receptor mRNA expression, ginseng polysugar has up regulation action for androgen receptor mRNA expression, and promote testosterone.
       Key words：Cold stress;  Ginseng polysugar;  Testosterone;  Androgen receptor
       本课题组的前期研究工作表明，冷应激可以损伤机体的生殖系统［1］，但有关冷应激致雄激素受体与睾酮的变化尚未见相关报道。人雄激素受体的cDNA序列揭示了一个含有2750核苷酸的开放阅读框架，编码分子量98999的受体蛋白，包含910～919个氨基酸残基［2］，大鼠雄激素受体由902个氨基酸组成，分子量98227［3］，两者在DNA和激素结合区的氨基酸序列有85%同源性，核酸水平的同源性为83%。为研究冷应激对哺乳动物睾丸生殖激素变化的影响，探讨人参多糖对其功能的调节作用，本实验建立冷应激大鼠模型，在整体与基因水平上观察了大鼠睾丸组织雄激素受体mRNA表达结果，检测了血浆睾酮含量及人参多糖抗冷应激的生物学效应。现报道如下。
       1  材料与方法
       1.1  材料
       1.1.1  动物体重250～300 g成年健康雄性大鼠，购自中国医科大学实验动物中心，在本实验室分笼饲养，颗粒饲料，自动饮水，适应1周后进行冷应激实验。
       1.1.2  试剂与仪器
       肝素购自Sigma公司，EDTA、乙醚与氯化钠购自沈阳化学试剂公司，睾酮放射免疫分析试剂盒购自北京北方生物技术研究所。二甲苯、PPO、POPOP、HCl、NaOH等均为分析纯。CO2培养箱，美国Shel-Lab公司产品，型号1815TC；超净工作台，江苏苏州安泰空气技术有限公司产品，型号SW-CJ-2FD；倒置相差显微镜，日本Olympus公司产品，型号CX21FS1；低温离心机，美国Beckman公司产品，型号J2-21；液闪仪，瑞典LKB公司产品（机效50%），型号LKB1211；Kontro γ –计数仪，瑞士公司产品，型号Kontro-28D。
       1.2  方法
       1.2.1  动物处理与血样的制备大鼠室温（16±2）℃饲养为对照组，4℃ 3 h/d饲养冷应激实验组，4℃ 3 h/d饲养冷应激给药组，每组各9只，饲养4周后，大鼠断头取血。肝素抗凝，分离血浆，置-20℃保存，备用于检测血浆睾酮，立即取睾丸液氮冻存，待提取总RNA与斑点杂交。
       1.2.2  血浆睾酮的放免测定取冻存血浆50 μl，平行双管加样，具体实验操作方法按试剂盒说明书提供的方法进行。单位nmol/L。
       1.2.3  睾丸组织ARmRNA的斑点杂交分析
       睾丸组织总RNA提取：参考异硫氰酸胍一步法［4］。取液氮冻存的睾丸组织，用预冷变性液1.0 ml（4 mol/L异硫氰酸胍，25 mmol/L柠檬酸钠，pH7.0，0.5%十二烷基肌酸钠，临用时加0.1 mol/L β-巯基乙醇）匀浆。然后，加100 μl 2 mol/L乙酸钠（pH4.0），颠倒混匀，加1.0 ml水饱和酚及200 μl氯仿/异戊醇（49：1），剧烈振荡1 min，冰浴15 min，12 000 r/min，4℃离心20 min。取上层水相至一新管中，加等体积冰冷的异丙醇，-20℃沉淀过夜，12 000 r/min，4℃离心10 min，弃上清液，沉淀中加0.3 ml变性液及0.3 ml异丙醇，颠倒混匀，-20℃沉淀2 h以上，12 000 r/min，4℃离心10 min，沉淀用75%乙醇洗1次，真空干燥，将沉淀溶于少量的DEPC水中，备用于紫外定量及斑点杂交用。
       雄激素受体cDNA探针的制备：大鼠ARcDNA重组质粒由美国Wilson教授惠赠，该片段包括ARcDNA中nt 963～nt 1 495 bp的序列，共532bp，构建在pGEM-3Zf(-)质粒中，JM109宿主菌由郭志儒博士惠赠。常规方法［5］制备感受态宿主菌，并将大鼠ARcDNA重组质粒转入感受态菌中，经蓝白筛选，确定含有ARcDNA重组质粒的转化菌。根据小量扩增的电泳行为，将含有重组质粒的阳性菌大量扩增、酶切、纯化、电泳定量，制备出大鼠ARcDNA片段。应用“随机引物法”，以［α-32P］dCTP标记大鼠ARcDNA片段，作为杂交探针。取大鼠ARcDNA片段（50 ng）2 μl，煮沸变性2 min，冰浴。依次加入下列成分：5×上样缓冲液10 μl，混合未标记的dNTP(dATP、dGTP、dTTP各1 μl)2 μl， BSA(10 mg/ml)2 μl，［α-32P］dCTP(50 μCi,3 000 Ci/mmol/L)5 μl，klenow 酶 1 μl(5 u)，加双氧水至总体积50 μl。混匀，室温反应60 min，煮沸2 min，冰浴，加0.5 mol/LEDTA 2 μl，备用。
       核酸杂交：各实验组与相应对照组取等量的睾丸组织总RNA进行1%变性琼脂糖凝胶电泳。然后，转移至尼龙膜上，转移时间18～24 h，80℃干烤2 h，预杂交和杂交在下列条件下进行，将载有RNA样品的尼龙膜在42℃与预杂交液充分接触，预杂交液为6×SSC， 50%甲酰胺，5×Denhardt’s液 (1 mg/ml BSA， 1 mg/ml聚蔗糖，1 mg/ml聚乙烯吡咯烷酮)，100 μg/ml的变性鲑精DNA， 0.5%SDS。2 h后，弃去预杂交液，将上述杂交液与探针同时加到杂交袋内，42℃振荡水浴24 h。杂交后，从杂交袋中取出尼龙膜，2×SSC， 0.5%SDS室温浸泡5 min，2×SSC， 0.1%SDS室温浸泡15 min，间或温和地摇动，0.1×SSC， 0.5%SDS 37℃温育30～60 min，0.1×SSC室温短暂漂洗尼龙膜，然后置于一叠纸巾上，去除大部分液体。用保鲜膜包好尼龙膜，在暗室内将X线底片置于膜的上下各1张，加双增感屏，夹紧置于暗盒中，-30℃曝光30 d，显影定影后观察结果。同时用噬菌体λDNA作为阴性对照，以载有ARcDNA 的重组质粒作为阳性对照。
       1.2.4  统计学处理方法睾酮含量各组数据均用±s表示，用t检验进行显著性检验，以P＜0.05表示。
       2  结果
       2.1  血浆睾酮含量检测如图1所示，冷应激实验组血浆睾酮含量与对照组比较差异显著P＜0.05。冷应激人参多糖实验组与冷应激实验组血浆睾酮含量比较无显著差异P＞0.05。
       2.2  Dot blot杂交分析图2是ARcDNA基因片段的电泳图，分子量532 bp。图3是睾丸组织总RNA变性胶电泳图，各道均可见28S、18S和5S 3条泳带，以28S为最强。Dot blot杂交放射性自显影结果为，3组均显示核酸杂交印迹。但表达的强度却不同，杂交信号的强度比较，冷应激实验组明显弱于对照组，冷应激人参多糖实验组弱于对照组但强于冷应激实验组见图4。
       3  讨论
       雄激素对靶器官的作用必须通过雄激素受体（AR）介导。AR含有3个功能区：激素结合区、DNA结合区和N端区。激素结合区位于受体蛋白的C端，雄激素与AR激素结合区结合，引起受体转化，使受体由非DNA结合型转化为DNA结合型，转化后的激素受体复合物利用DNA结合区与靶基因中激素反应元件相互作用，产生生物效应。因此，本文在整体与基因水平上研究血浆睾酮与睾丸雄激素受体的变化，对于揭示冷应激后睾丸生殖功能的变化具有重要意义。到目前为止，未见有关冷应激大鼠睾丸雄激素受体mRNA表达与血浆睾酮变化的相关报道。本实验应用大鼠ARcDNA片段（540 bp）作为探针，对大鼠的睾丸组织进行了ARmRNA的Dot – blot杂交分析。结果两组实验组与对照组表达的强度均有所不同。表明冷应激对睾丸组织ARmRNA表达强度具有一定的影响， 睾丸ARmRNA表达强度的变化与血浆睾酮含量的变化关系显示出一致性。这与Lammoglia［6］和Gwazdauskas［7］对牛的观察结论，饲养在寒冷环境下的牛，体内肾上腺功能低下，雌三醇与睾酮水平减低，影响受孕的实验结果相似。本研究组曾研究了人在冷冻应激条件下，血细胞总RNA的含量变化，其实验组与正常对照组具有明显的区别，血浆睾酮与RNA含量下降的机制可能与低温效应产生的机体血液循环减慢，代谢功能受到影响及垂体-肾上腺-靶器官的反馈调节有关。人参多糖的调节作用提示其对冷应激刺激具有很好耐受能力。
       【参考文献】
         　　［1］孙 艳，吴 扬，王洪军，等. 冷冻应激对Wistar雌性大鼠生殖周期与生育能力的影响［J］. 中国妇幼保健杂志，2006，21（22）：3137.
       
       ［2］Block LJ,Bartlett JM,Bolt-de vries J,ThemmenAp,BrinkmannAo,Weinbauer GF,NieschlagE,Grootegoed JA. Regulation of androgen receptor mRNA and protein in the rat testis by testosterone［J］. J Steroid Biochem Mol Biol, 1991，40(1-3):343.
       
       ［3］Nappi RE, Guo AL, Petraglia F, Bonati ME, Criscuolo M, Ficarra G, Zara C, Genazzani AR. Pituitary and ovarian interleukin-1 alpha content changes according to estrous cycle and acute stress exposure［J］. Gynecol Endocrinol. 1994，8(4):259.
       
       ［4］F.奥斯伯，R.布伦特，R. E. 金斯顿，等. 精编分子生物学实验指南［M］. 北京：科学出版社，1998.
       
       ［5］J.萨姆布鲁克， E.F. 弗里奇，T. 曼尼阿蒂斯. 分子克隆实验指南［M］. 北京：科学出版社，2002.
       
       ［6］Lammoglia MA, Bellows RA, Grings EE, Bergman JW, Short RE, MacNeil MD. Effects of feeding beef females supplemental fat during gestation on cold tolerance in newborn calves［J］. J Anim Sci. 1999，77(4):824.
       
       ［7］Gwazdauskas FC. Effects of climate on reproduction in cattle［J］. J Dairy Sci. 1985，68(6):1568.