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       【摘要】 
       目的研究双料喉风散中4味药材的最佳提取条件。方法采用正交设计法，以体外抑菌效果和苦参碱、盐酸小檗碱的含量为指标，以醇浓度、提取液倍数、提取次数、提取时间为因子进行实验。结果双料喉风散中4味药材的最佳提取条件是A1B1C2D3：即是用8倍量70%乙醇回流提取3次，第1次1 h，第2次1 h，第3次30 min。结论优选得到的工艺稳定可行。
       【关键词】  正交实验 体外抑菌 山豆根 黄连 提取工艺
       Study on the Extraction Process of Shuangliao Houfeng Medicament
       LIU Na, LIN Huaqing, DENG Hong, ZHANG Shu
       (Guangdong Pharmaceutical College, Guangzhou Provincial Key Laboratory of Advanced Drug Delivery， Guangzhou 510008, China)
       Abstract:ObjectiveTo study the best extraction process for four herbs that are composed of Shuangliao Houfeng medicament.MethodsUsing in vitro inhibitory effect extraction time and the contents of matrine and berberine hydrochloride in the extract as indexes, orthogonal design was perfornied to optimize the process. The effect of four factors such as alcohol concentration,the proporation of water volume and the mumber of extraction were investigeted. ResultsIt proves the optimum process conditions were A1B1C2D3  which meant 8 times amount of 70% ethanol by cycle extraction for 3 times, the first time and the second time with 1hour, eventually with 0.5 hour for cycle extraction.ConclusionThe optimized process is feasible for the extraction.
       Key words:Orthogonal design;  Test in vitro inhibitory;  Euchresta japonica;  Coptidis rhizome;  Extraction technology
       
       双料喉风散由山豆根、黄连、甘草和青黛等中药组成，具有清热解毒、消肿利咽等功效，用于肺胃热毒炽盛所致的咽喉肿痛、口腔糜烂、齿龈肿痛、鼻窦脓肿、皮肤溃烂等症；同时，对褥疮、脓疱疮、脚气、外耳道炎、新生儿臀部红斑等病症的治疗，经临床验证，疗效显著，可明显减轻症状［1］。但该方为散剂，在口腔中停留时间短，影响其疗效。为将其制成制剂，本实验对该方中的部分组分（山豆根、黄连、甘草和青黛）提取工艺进行筛选，确定该复方的最佳提取工艺。
       1  仪器与试药
       Ultimate3000液相色谱仪(美国戴安)，PDA-3000型检测器，CHROMELEON Version数据处理机；SW-CJ-1FD型单人单面净化工作台，苏州净化设备有限公司；MGC-300H智能型人工气候箱；旋转蒸发RE52-05，上海亚荣生化仪器厂。 
        
       苦参碱、盐酸小檗碱对照品，购自中国药品生物制品检定所；含量测定用水为重蒸馏水，甲醇、乙腈为色谱纯，其它试剂均为分析纯。
       山豆根、黄连、甘草、青黛均购自广州致信中药饮片有限公司，批号060901。黄连产地四川、山豆根产地广西、甘草产地内蒙古、青黛产地广东，经检验符合《中国药典》规定。
       菌株：金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、绿脓杆菌（本院微生物实验室保留菌株）。培养基：普通营养琼脂培养基。
       2  方法与结果
       2.1  正交实验设计在参考文献［2～4］和大量单因素实验的基础上，本研究选用70%，60%，50% 3个浓度的乙醇，以苦参碱和盐酸小檗碱的含量及浸膏对常见口腔致病菌的抑菌效力综合测评值为指标，对不同浓度的乙醇用量及提取时间、次数进行L9(34)正交实验，筛选最佳工艺条件。实验因素及水平见表1。表1  因素水平（略）
       2.2  提取工艺药材饮片加入乙醇溶液，浸泡过夜，加热回流提取，合并提取液，旋转蒸发回收乙醇，水浴挥干，真空干燥，制备成干浸膏备用。
       2.3  工艺评价指标的测定方法
       2.3.1  体外抑菌实验精密称量样品0.1 g，加入4滴无菌吐温80，混匀，再加入5 ml pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，摇匀，即得浓度约20 mg·ml-1提取物供试液。
       
       将灭菌好的培养基趁热倒入无菌的培养皿，水平静置凝固后，在无菌操作台内用无菌涂布棒蘸取细菌在培养基表面均匀涂抹。用无菌镊子夹取无菌的牛津杯，放入已接种好的培养基中，每块培养基放入相同浓度的9个正交实验的提取物供试液。每种细菌重复做3组。
       将培养皿倒置放入恒温箱中，37℃恒温培养24 h，测量抑菌圈直径，比较对各实验菌的抑菌效力的大小。结果见表2。表2  抑菌实验结果抑菌圈平均直径（略）
       2.3.2  苦参碱的含量测定方法对照品溶液的制备：精密称取苦参碱对照品，用甲醇溶解，制得每毫升中的含苦参碱50 μg的对照品溶液。
       供试品溶液的制备：精密称取提取物干品0.15 g，置50 ml容量瓶中，加0.5 ml氨水，加适量氯仿，超声提取40 min，放冷，用氯仿稀释至刻度，摇匀，滤过，水浴挥干。甲醇溶解，转移置10 ml容量瓶中，摇匀，0.45 μm微孔滤膜过滤，即得。色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为固定相；0.01 mol·L-1NaH2PO4水溶液（0.02%三乙胺）-乙腈为流动相进行梯度洗脱；检测波长210 nm；进样量20 μl；理论塔板数按苦参碱峰计算,应不低于3 000；测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20 μl，注入高效液相色谱仪，测定峰面积，外标法计算，即得。
       2.3.3  盐酸小檗碱的含量测定方法对照品溶液的制备：精密称取盐酸小檗碱对照品，用甲醇溶解，制得每毫升中约含盐酸小檗碱50 μg的对照品溶液；供试品溶液的制备：同“2.3.2”项中供试品溶液的制备方法；色谱条件与系统适用性实验：用十八烷基硅烷键合硅胶为固定相；乙腈-0.033 mol·L-1KH2PO4水溶液（磷酸调pH至3.70）(28∶72)为流动相；检测波长为345 nm，进样量10 μl，理论塔板数按盐酸小檗碱峰计算，应不低于2 000；测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μl，注入高效液相色谱仪，测定峰面积，外标法计算，即得。
       2.4  指标测评及处理正交实验结果见表3，方差分析结果见表4～6。表3  L9(34)正交实验结果（略）表4  体外抑菌方差分析（略）表5  苦参碱方差分析（略）表6  盐酸小檗碱方差分析（略）
       从表4～6可以看出，用对体外抑菌实验影响最为显著的是提取次数，优先顺序为：D>A>B>C；对苦参碱的含量影响最为显著的是醇的浓度，优先顺序为：A>B>D>C；对盐酸小檗碱含量影响最为显著的是提取次数，优先顺序为：D>C>A>B。从表3可以看出，用正交设计表得出的最佳工艺，体外抑菌和盐酸小檗碱的完全相同为A1B3C3D3，苦参碱为A1B1C1D1。结合生产实际，综合考虑，3个评价指标确定。该复方的最佳提取工艺为A1B1C2D3，即是用8倍量70%乙醇回流提取3次，第1次1 h，第2次1 h，第3次30 min。
       2.5  验证最佳提取工艺按确定的最佳提取工艺：用8倍量70%乙醇回流提取3次，第1次1 h，第2次1 h，第3次30 min。重复提取3批，测的苦参碱含量分别为：1.46%，1.64%，1.62%；盐酸小檗碱含量分别为：2.89%，2.86%，2.87%。复方中有效成分的平均提取率及抑菌效果均达到理想要求。实验结果证明该工艺稳定可行。
       3  讨论
       本研究用干浸膏对常见口腔致病菌的敏感性进行药效评价。白色念珠菌为口腔黏膜感染的重要致病菌,其粘附黏膜细胞表面是其侵袭致病的先决条件［5,6］。金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌也是口腔溃疡时重要的致病菌，故选用这3个菌种作为药效评价的指标。
       由于君药山豆根中苦参碱不宜加热时间过长，故综合考虑将3次提取时间定为第1次1 h，第2次1 h，第3次30 min。验证实验结果表明干浸膏中苦参碱和盐酸小檗碱的含量均到达了理想要求。该提取工艺方法简便、实用、经济，符合工业化大生产的要求。
       【参考文献】
         　　［1］梅全喜,蔡日强.双料喉风散的临床新用［J］.中药材，2002,25(9):693.
       
       ［2］宋茹,王媛媛.山豆根合剂的质量标准研究［J］.时珍国医国药，2001,12(8):693.
       
       ［3］张学顺,赵晓义,郭仲平.RP-HPLC法分析优选黄连提取方法［J］.齐鲁药事，2005,24(15):281.
       
       ［4］刘玉红,崔红梅,陈 燕.正交试验法研究甘草的提取工艺［J］.中成药，2004,26(3):239.
       
       ［5］邓 靖.壳聚糖对几种口腔常见致病菌的体外抑制作用［J］.上海口腔医学，2005,14(1):74.
       
       ［6］AmanoA, KuboniwaM, NakagawaI, etal. Prevalence of specifgeno types of PorphyromonasgingivalisfimAandperiodonthealthstatus［J］.JDentRes,2000,79(9):1664.