【摘要】 目的研究消敏颗粒抗大鼠Ⅰ型超敏反应的免疫学机制。方法用卵白蛋白与AI(OH)悬液的混合液致敏和诱发，制成Ⅰ型超敏反应动物模型。将实验动物随机分组，即正常组、模型组、消敏颗粒低、高剂量组、扑尔敏组，分别给予相应的药物进行动物实验。采用ELISA法测定致敏大鼠血清IgE含量。采用RT-PCR 方法，检测致敏大鼠脾淋巴细胞分泌IFN-γ mRNA、IL-4 mRNA的表达水平。结果消敏颗粒可降低血清总IgE含量，可促进IFN-γ及mRNA表达，抑制IL-4 mRNA表达（P<0.01或P<0.05），均有显著性差异。结论消敏颗粒具有抗Ⅰ型超敏反应的作用。
【关键词】 消敏颗粒 Ⅰ型超敏反应 免疫球蛋白E γ干扰素 白介素-4
Effects of Xiaomin Granules on the Content of Serum IgE and the Expression of IFN-γmRNA,IL-4mRNA in Spleen Cell of Type ⅠHypersensitive Rats
LI Xinhong, WANG Huiguo, GUAN Hongquan
1. Affiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110032，China；
2. Liaoning Provincial Traditional Chinese Medicine Hospital，Shenyang 110032，China
Abstract：ObjectiveTo investigate the immunological mechanism of Xiaomin granules on type Ⅰ hypersensitivity.MethodsTo sensitize and lead rat with the mixture of (OVA)and AI(OH).To make the experimental animal model for type Ⅰhypersensitivity. Divide the animals for experiment into groups randomly, named normal group，model group，vacant control group, Xiaomin granule (low-and high-dose)groups, chlorpheniramine group, and experimentize the anminals with homologous medication respectively. The IgE content in serum of sensitized rats was measured with ELISA. T Lymphocytes in Sensitized rats measured with RT-PCR.ResultsXiaomin granules could decrease the content of IgE in serum，increase the expression of IFN-γ mRNA，inhibit the expression of IL-4 mRNA（P<0.01 or P<0.05）.They all had remarkable differences.ConclusionXiaomin granules has the effect on the Type Ⅰ hypersensitivity.
Key words：Xiaomin granules； Type Ⅰ hypersensitivity； IgE； IFN-γ; IL-4
Ⅰ型超敏反应是主要由IgE介导的速发型超敏反应，消敏颗粒在临床治疗慢性荨麻疹等Ⅰ型超敏反应性疾病取得良好的疗效，为了进一步研究其治疗机制，本文通过大鼠Ⅰ型超敏反应动物模型，观察抑制IgE产生的作用，探讨消敏颗粒抗Ⅰ型超敏反应的免疫调节机制。
1 器材 1.1 动物Wistar大鼠50只,体重200～220 g，雄雌各半，购自辽宁中医药大学实验动物中心，分笼饲养于辽宁中医药大学实验动物中心实验室。随机分5组，即正常组、模型组、消敏颗粒低、高剂量组、扑尔敏组。
1.2 药物消敏颗粒（由消敏饮制备），组方为黄芪20 g，防风15 g，当归15 g，金银花15 g，芥穗15 g，蒺藜15 g，甘草15 g，购自辽宁中医药大学附属医院。生理盐水注射液，哈尔滨三联药业有限公司产品；扑尔敏，北京太平洋药业有限公司产品。
1.3 试剂卵白蛋白，AI(OH)国药集团化学试剂公司产品；1gE ELISA试剂盒，上海森雄公司分装；Trizol，invitrogen公司；DEPC，DNA-marker DL2000，Rt-pcr试剂盒，宝生物工程有限公司（TaKaLa）产品。
1.4 引物序列设计本实验选用GAPDH（三磷酸甘油醛脱氢酶）为内参照，根据文献报道在IFN-γ，IL-4［1］，GAPDH序列5", 3"分别设计上下游引物，并在美国国立生物信息中心基因库(
http://www．ncbi．nlm．nih．gov/)进一步核准大鼠基因全序列。目的基因及内参照GAPDH引物由北京华大基因中心合成，基因序列见表1。表1 PCR引物（略）
1.5 仪器
550号微孔板酶标仪（美国BIO-RAD公司生产）；酶标仪洗板机（美国BIO-RAD公司生产）；DY89-Ⅰ电动玻璃匀浆机（宁波新芝科器研究所生产）；BIOFUGE28RS低温高速离心机（德国HERAEUS生产）；PE9600 PCR仪（美国PERKIN ELMER生产）；EPS-300电泳仪（上海天能生产）；DYCP-33A电泳槽（北京六一仪器厂生产）。
2 方法 2.1 消敏颗粒制备消敏饮取14剂，分别将药物混合后浸泡30 min，煮沸后继续煎30 min，共煎2次，合并2次煎液，并分别浓缩至糖浆状，再与糊精混合均匀，粉碎干燥，在阴凉干燥处保存，使消敏颗粒每克含生药1 g。实验时将消敏颗粒浓度调配成为每毫升含生药1，3 g。
2.2 给药方法灌胃量4 ml/只，正常组和模型组每天灌服生理盐水4 ml/只；低剂量组、高剂量组分别灌服消敏颗粒20，60 g/kg；扑尔敏组4 mg/kg。
2.3 I型超敏反应动物模型的制备以生理盐水配制AI(OH)悬液(10 g/L)，除正常组各组大鼠均腹腔注射卵白蛋白(OVA 1 mg)与AI(OH)悬液(1 ml)的混合液进行初次免疫，第10天重复1次。从初次免疫后第6天开始给药，共14 d。
2.4 实验方法和观察指标
2.4.1 消敏颗粒对大鼠血清IgE生成的影响第14天，Ⅰ型超敏反应大鼠模型未处死前取血，离心后取血清。采用ELISA法测定致敏大鼠血清IgE含量，按ELISA试剂盒说明书操作，显色终止后酶标仪测定450 nm处光吸收值，按标准曲线计算待测样品中IgE的浓度。
2.4.2 消敏颗粒对IFN-γ mRNA、IL-4 mRNA表达的影响采用RT-PCR (逆转录多聚酶链式反应)方法，检测对致敏大鼠脾淋巴细胞分泌的IFN-γmRNA、IL-4 mRNA表达的情况。大鼠处死后取脾组织，进行总RNA提取，然后将动物细胞总RNA反转录成cDNA，检测cDNA中Bcl-2 mRNA序列，PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，置于紫外线检测仪上观察结果，并拍照留做记录，电泳结果采用凝胶图像分析系统进行数据分析，分析特异性扩增条带的各强度值。IFN-γ mRNA及IL-4 mRNA的表达用Bcl-2 mRNA相对表达量表示（Bcl-2 mRNA相对表达量=Bcl-2带强度值/内参条带强度值）。
2.5 统计学方法计量资料实验数据以±s表示。所获数据采用 SPSS10.0版本软件进行单因素方差分析，方差齐性检验用Homagenelty of variance test；组间比较，方差齐者采用LSD法，方差不齐者采用Tamhane’s T法。
3 结果
3.1 消敏颗粒对大鼠血清IgE生成的影响见表2。模型组血清IgE含量明显高于正常组，说明造模成功。消敏颗粒低、高剂量组及扑尔敏组均低于模型组，其中高剂量组及扑尔敏组降低更明显，与模型组比较有显著性差异（P<0.01），但两者间无显著性差异（P>0.05），且高剂量组与正常组亦无显著性差异（P>0.05）。表2 消敏颗粒对大鼠血清IgE生成的影响(略)
3.2 消敏颗粒对IFN-γ mRNA、IL-4 mRNA表达的影响见图1，脾组织中IFN-γ、IL-4和内参照扩增后电泳结果，消敏颗粒组和扑尔敏组IFN-γ cDNA经扩增后可见光亮的条带，消敏颗粒高剂量组和扑尔敏组强于其它组。模型组IL-4 cDNA扩增后其亮度增强于正常组和各用药组，正常组条带最暗。
见表3，大鼠脾组织IFN-γ mRNA的表达模型组显著低于正常组(P<0.01)；治疗后各组表达增强，消敏颗粒高剂量组和扑尔敏组增加更明显，与模型组比较差异有显著意义(P<0.01)。大鼠脾组织IL-4 mRNA的表达模型组显著升高，与正常组比较差异具有显著性意义(P<0.01)，模型组与治疗各组比较差异具有显著性意义，其中与消敏颗粒高剂量组和扑尔敏组差异更显著(P<0.01)，且消敏颗粒高剂量组与扑尔敏组比较差异无显著性（P>0.05）。
4 讨论 以慢性荨麻疹为代表的皮肤Ⅰ型超敏反应的发生，主要是以IgE介导，导致肥大细胞、嗜碱性粒细胞等释放一系列生物活性介质， 从而引起机体生理功能发生紊乱。针对某种变应原的特异性IgE 型抗体是引起I 型超敏反应的主要因素。正常情况血清中总IgE 抗体含量很低，而发生Ⅰ型超敏反应时，IgE 抗体含量则显著增高。所以，在该类疾病治疗中，主要以抑制IgE产生为目的。
另外，Th1/Th2亚群及其相互之间的平衡在免疫应答的调节中起着关键的作用。Th2促进B细胞产生IgE抗体，IgE在与肥大细胞和嗜碱性粒细胞上的高亲和力IgE受体FcεR I结合而使机体处于致敏状态，当变应原再次进入机体结合IgE后，诱发速发型超敏反应［2］。Romagnani报告，Th2细胞在变态反应性疾病中的作用并非仅仅局限于促进B细胞产生IgE，也可以通过产生1L-4，5，13等Th2型细胞因子直接或间接地引起超敏反应的病理生理改变和临床表现［3］。IL-4可诱导B淋巴细胞的IgE 合成和分泌，也可诱导角质形成细胞低亲和力IgE受体的表达和细胞因子的合成和分泌［4］。Th2 细胞的活化可被Th1 细胞分泌的细胞因子IFN-γ 和DC、巨噬细胞分泌的IL-12 抑制。因此，提高Th1 细胞活性，减少IL-4 及IL-13 的产生，进而增加IgG（如IgG4）抗体产生，可降低IgE 抗体的产生。Th1和Th2之间通过细胞因子而互相调节。目前研究已经表明，IL-4可以促进IgE合成，而IFN-γ能抑制IL-4所诱导的IgE合成，说明Th1和Th2细胞均调控IgE的合成。 因此，IL-4和IFN-γ的相互制约的平衡调节可能是IgE合成的重要因素。表3 消敏颗粒对IFN-γmRNA，IL-4mRNA表达的影响(略)
本实验结果表明Ⅰ型超敏反应模型大鼠血清IgE含量明显升高，治疗各组均能降低IgE水平，消敏颗粒高剂量组降低更明显，基本恢复正常，疗效与扑尔敏组相当。模型组脾组织IFN-γ mRNA的表达显著降低，用药后治疗各组明显恢复，消敏颗粒高剂量组恢复较明显。模型组脾组织IL-4 mRNA的表达显著升高，治疗各组表达水平均下降，其中消敏颗粒高剂量组和扑尔敏组下降更显著，且二者疗效相当。提示消敏颗粒可以抑制血清总IgE产生，还提示消敏颗粒也可通过提高IFN-γ，降低IL-4，抑制IgE的产生，说明消敏颗粒治疗慢性荨麻疹等皮肤Ⅰ型超敏反应性疾病可通过抑制IgE的产生这一免疫学机制完成。
【参考文献】 ［1］付文祥，谢 慧，熊大经．五龙颗粒对实验性AR大鼠IL-4、IFN-γ mRNA表达的影响［J］．中国中西医结合耳鼻咽喉科杂志，2006，l4（4）：208.
［2］金伯泉．细胞和分子免疫学，第2版［M］.北京：科学技术出版社，2001：405.
［3］Romagnani S. The role of lymphocytes in allergic disease［J］.J Allergy Clin Immunol，2000，105(3):399.
［4］吴慧珍，张学奇，张文辉，等．血清中IL-4 和TNF-α水平与慢性荨麻疹的相关性［J］. 中华微生物学和免疫学杂志，2003，23 (7):561.