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       【摘要】 
       目的探讨蛹虫草提取物抗肿瘤作用的特点。方法采用化学比色法分别测定蛹虫草提取物对H22荷瘤小鼠血清中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)，过氧化氢酶(CAT)，丙二醛的影响(MDA)，对肝脏中SOD，GSH-Px的影响。结果蛹虫草提取物可使小鼠血清中SOD，GSH-Px，CAT，肝脏中SOD，GSH-Px水平明显升高；使血清中MDA水平降低。结论蛹虫草提取物通过调整荷瘤动物的抗氧化能力而达到抗肿瘤作用的目的。
       【关键词】  蛹虫草提取物 荷瘤小鼠 超氧化物歧化酶 谷胱甘肽过氧化物酶 过氧化氢酶 丙二醛
       Effect of the Extract from Cordyceps militaris on Antioxidation of Mice Bearing H22 Tumor Cells
       ZHANG Xiujuan, YANG Shanshan, LIU Baihua, JI Yubin
       1.Center of Reserch & Development on Life Science and Environmental Sciences,Harbin University of Commerce,Harbin150076,China;
       2.Engineering Research Center of Anti-tumor Natural Drug,Ministry of Education, Harbin University of Commerce,Harbin 150076,China
       Abstract：ObjectiveTo study the antitumor effects of the extract from Cordyceps militaris(L.) Link. MethodsThe colorimetric analysis was adopted  to determine the level of superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase (GSH-Px), catalase (CAT) and malondialdehyde (MDA) in serum as well as SOD and GSH-Px in liver of mice of H22. ResultsThe extract from Cordyceps militaris (L.) Link could increase the activities of SOD, GSH-Px and CAT in serum as well as SOD and GSH-Px in liver of mice of H22 decrease the level of MDA in serum.ConclusionThe antitumor mechanism of extract from Cordyceps militaris (L.) Link. may be to regulate  the antioxidative activity of H22mice.
       Key words：Extract from Cordyceps militaris(L.) Link;  Mice bearing tumor;  Superoxide dismutase;  Glutathione peroxidase;  Catalase;  Malondialdehyde
       
       冬虫夏草Cordyceps sinesis (Berk.) Sacc为麦角菌科虫草属植物，是我国传统的滋补性中药。多年来的研究表明，冬虫夏草具有抗肿瘤、抗衰老、抗菌抗炎、提高机体免疫功能等药理性质［1］；作为冬虫夏草的替代品，蛹虫草Cordyceps militaris(L.) Link具有相似的药理作用［2，3］，这对扩大癌症预防、治疗的药物来源具有特殊意义。为了探讨蛹虫草抗肿瘤作用特点，本文从蛹虫草提取物对荷瘤小鼠抗氧化能力方面进行了初步研究。
       1  材料与仪器
       1.1  动物与瘤株
       昆明种小鼠18～22 g，♀♂各半，哈尔滨医科大学附属肿瘤医院动物所提供(动物质量合格证号：黑动字第00101003号)；H22腹水瘤，由哈尔滨医科大学附属肿瘤医院动物所提供。
       1.2  药品与试剂
       蛹虫草提取物：蛹虫草菌丝体与孢子粉运用多糖提取工艺分离得到，粗多糖含量大于35%：东北林业大学李大靖博士提供；黄芪多糖，哈尔滨商业大学药物研究所提供；超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX）试剂盒、过氧化氢酶（CAT）试剂盒、丙二醛（MDA）试剂盒、考马斯亮兰蛋白试剂盒，均购自南京建成生物研究所；其它试剂均为分析纯。
       1.3  仪器
       UV－2102C型紫外可见分光光度计，上海UNICO仪器有限公司产品；LXJ- II型离心沉淀机，上海医用分析仪器厂产品；电热恒温干燥箱，连云港医疗器材设备厂（HH.B11.420型）产品；XK9型旋涡振荡器：江苏江堰市新康仪器厂产品；电热恒温水浴锅，上海益恒实验仪器有限公司DKZ系列产品。
       2  方法
       2.1  分组、给药剂量及途径无菌条件下抽取接种第7天的H22荷瘤小鼠腹水（癌细胞数>95%），无菌生理盐水稀释至1∶4，按0.2 ml/只（5×107个细胞·ml-1），腹腔接种。连续给药10 d，小鼠随机分为5组，每组12只，分别为蛹虫草粗提取物高（4.0 g·kg-1）、中（2.0 g·kg-1）、低剂量组（1.0 g·kg-1），灌胃给药；阳性对照组：黄芪多糖2 g·kg-1，灌胃给药；阴性对照组：同体积生理盐水组，给药方式同上。
       2.2   样本的采集血样的采集：停药次日，将小鼠称重，眼眶取血置于肝素抗凝的试管中，混匀，分成两部分，一部分3 000 r·min-1离心10 min，收集上层无溶血的血浆于EP管中，2℃冰箱中保存备用，1周内测定。10%组织匀浆的制备：取组织块，用冰冷的生理盐水漂洗，除去血液，滤纸拭干，称重0.5 g放入10 ml小烧杯内。用量筒量取预冷的生理盐水，0.86%生理盐水的量是组织重量的9倍。用移液管将总量2/3的生理盐水移入烧杯。将剪碎组织倒入玻璃匀浆管中，再将剩下的0.86%生理盐水用来冲洗残余在小烧杯的组织一起倒入玻璃匀浆管中进行匀浆，充分磨碎，使组织匀浆化。
       2.3   血清及肝脏SOD的测定按照试剂盒说明测其吸光度，求出被测样品中的SOD活力。
       总SOD活力（U/ml）=对照管OD值-测定管OD值对照管OD值÷反映体系稀释倍数×样品测试前稀释倍数组织匀浆中SOD活力（U/ml）=对照管吸光度-测定管吸光度对照管吸光度÷50×反应液总体积取样量/ml÷组织中蛋白含量（mgprot·ml-1）
       2.4   血清及肝脏GSH-Px的测定 按照试剂盒说明测其吸光度并算出GSH-Px活力。
       全血GSH-PX酶活力=（非酶管OD值-酶管OD值）×165.16×稀释倍数
       组织GSH-PX酶活力=（非酶管OD值-酶管OD值）×165.16÷待测浓度样本蛋白含量
       2.5  血清CAT的测定按照试剂盒说明书方法测其吸光度。
       CAT活力=logOD1OD2×2.30360×A÷B
       A为血红蛋白或组织蛋白的稀释倍数（包括样品测试前稀释倍数及取样量在反应液中稀释倍数）；B为样本中每毫升血红蛋白克数或者每毫升组织蛋白克数。
       2.6  血清中MDA含量的测定采用硫代巴比妥酸（TBA）法测定。
       血清（浆）中MDA含量=测定管OD-测定空白管OD标准管OD-标准空白管OD×标准品浓度10 nmol/ml×样本测试前稀释倍数
       2.7  数据处理数据用±s表示，组间比较，采用t检验，SPSS 10.0进行统计学分析。
       3  结果
       3.1  蛹虫草提取物对H22荷瘤小鼠SOD的影响由表1可知，蛹虫草提取物（CME）中剂量对小鼠血清SOD，与阴性对照组相比有显著差异(P<0.05)，同时CME高剂量、黄芪多糖有极其显著差异(P<0.01)；CME中剂量组中与阴性对照组相比，对肝组织SOD有显著差异(P<0.05)，CME高剂量、黄芪多糖有极其显著差异(P<0.01)；同时还可以看出，CME低剂量组血清、肝脏中SOD活性与阴性对照组没有明显差别。
       表1  蛹虫草提取物对H22荷瘤小鼠SOD的影响 (略)
       3.2  蛹虫草提取物对H22荷瘤小鼠GSH-Px的影响由表2可知，蛹虫草提取物低、中、高剂量组和黄芪多糖组较阴性对照组的血清的GSH-Px活力较明显升高，有显著性差异(P<0.01)；在肝脏组织中CME低剂量与黄芪多糖组对荷瘤小鼠阴性对照组相比有明显的升高，具有显著性差异(P<0.05)，CME中、高剂量组比阴性对照组有明显的升高，有极其显著性差异(P<0.01)。表2   蛹虫草提取物对H22荷瘤小鼠GSH-Px的影响(略)
       3.3   蛹虫草提取物对H22荷瘤小鼠血清CAT，MDA的影响表3结果显示，CME低剂量组与阴性对照组相比较，全血中CAT含量有显著性差异(P<0.05)，CSE中、高剂量组能够明显提高全血中CAT含量，具有极其显著性差异(P<0.01)。血清中脂质过氧化产物MDA含量明显降低，CME低、中、高剂量组、黄芪多糖组与阴性对照组显著性差异(P<0.01)。表3  蛹虫草提取物对H22荷瘤小鼠血清CAT及MDA的影响(略)
       4  讨论
       近年来，自由基反应及脂类过氧化损伤的理论研究揭示了自由基反应与肿瘤的发生和发展密切相关，肿瘤导致机体内氧化功能受损，DNA被过量的活性氧氧化损伤，影响基因表达，同时肿瘤组织氧自由基发生脂质过氧化反应增强，产生脂质过氧化物增多，而脂质过氧化物可与蛋白质交叉连接，影响细胞膜和有丝分裂，脂质羟化氧化物有类似染色体畸变因子的作用，这些都表明脂质过氧化与肿瘤的形成与发展有关，是活性氧诱发肿瘤形成的中间机制之一。荷瘤小鼠体内糖酵解关键酶活性增高，即使是在有氧的条件下仍然依赖无氧酵解供能，其后果是引起细胞内氧含量增多，导致氧的活性衍生物增加。损伤细胞使细胞质和细胞核中的核酸链断裂，导致肿瘤生长［4］。
       体内脂质过氧化保护系统由抗氧化物酶系统和抗氧化剂组成，超氧化物酶SOD是超氧化自由基的特异性清除酶，又是超氧阴离子的底物诱导酶，其功能是保护细胞免遭有氧代谢反应中产生的超氧阴离子的损伤，因此，SOD是机体内超氧离子清除剂，对机体起保护作用。GSH-Px是体内广泛存在的一种重要的催化过氧化氢分解的酶，它特异的催化还原型谷胱甘肽(GSH)对过氧化氢的还原反应，可以起到保护细胞膜结构功能完整的作用。过氧化氢酶也是一种主要的过氧化氢分解酶，是体内仅次于GSH-Px的过氧化物酶。体内SOD，GSH-Px等活力高低间接反映了机体清除自由基的能力。MDA为脂质过氧化产物，它的高低间接反应了机体细胞受自由基攻击的严重程度。
       实验结果看出，经过蛹虫草提取物灌胃的荷瘤小鼠比阴性对照组小鼠血清与肝脏中SOD水平明显升高，即蛹虫草提取物能调动或激活机体内源性抗氧化体系，SOD既然可清除·O－2，当然在一定程度上也可使肿瘤细胞的分裂受到影响，即DNA生物合成受到了抑制，这种效应可能使肿瘤不至于扩大。同时还可以提高荷瘤小鼠血清中GSH-Px及CAT的含量，进而加速过氧化物将过氧化氢H2O2转化为H2O和O2，减少由于肿瘤造成的细胞、组织的损伤而产生的过氧化产物，消除自由基，抑制机体过氧化进程。
       本实验结果还可看出，经过蛹虫草提取物灌胃的荷瘤小鼠与阴性对照组相比较，小鼠血清中过氧化脂质的产物丙二醛（MDA）水平明显降低(P<0.05或P<0.01)，提示蛹虫草提取物能够增强荷瘤小鼠机体抗氧化能力。这说明蛹虫草提取物能提高荷瘤小鼠过氧化物酶的活力，抑制氧自由基的产生与发展，因此降低了肿瘤对机体组织的过氧化损伤，从而保护荷瘤机体的组织、细胞的功能完整性，使机体的免疫功能得到保护。故蛹虫草提取物能够间接提高荷瘤机体的免疫功能。
       【参考文献】
         　　［1］陈桂宝，罗梅初，刘实晶，等.蛹虫草的药理作用研究［J］.中草药，1997，28：415.
       
       ［2］吴庆光，赵珍东，王宗伟.冬虫夏草抗肿瘤作用研究进展［J］.中医药导报，2005.11（6）：80.
       
       ［3］宋江峰，刘春泉，李大婧，等.北冬虫夏草多糖活性研究进展［J］.江苏农业科学，2006，4：145.
       
       ［4］Bravard A, Ageron-Blanc Agnes, Alvarez S,etal.Correlation between antioxidant status, tumorigenicity and radiosensitivity insister rat cell lines［J］.Carcinogenesis, 2002,23(5):705.