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       【摘要】 
       目的测定玉金方对人胚肺成纤维细胞的传代与微细胞结构的影响。方法用含玉金方的血清培养人胚肺成纤维细胞，同时设空白对照组和福康乐阳性对照组，比较细胞传代情况和微细结构。结果玉金方组与阳性对照组细胞传代数均比空白对照组多，且细胞衰老现象比空白对照组出现的迟缓。结论玉金方胶囊有显著的体外抗衰老作用，也为其临床应用提供了血清药理学的依据。
       【关键词】  玉金方 人胚肺成纤维细胞 抗衰老作用
       Effect of YuJinFang on Cultivation and Passage and Fine Structure of Human Embryonic Lung Fibroblast
       ZHAI Na, XU Qitai
       (College of Pharmacology, Henan University , Kaifeng,Henan  475004, China)
       Abstract：ObjectiveTo study the effect of YuJinFang caps on cultivation and passage and fine structure of human embryonic lung fibroblast.MethodsTo cultivate human embryonic lung fibroblast with blood serum containing YuJinFang,meanwhile set up blank control group and FuKangLe positive control group,to compare condition of cell passage and fine structure. ResultsThe passage number in YuJinFang group and positive group was more than that in blank control group,and phenomenon of cell aging was slower than that in blank control group. ConclusionFuKang capsule has anti-aging effect,which can provide serum pharmacological basis for its clinical application.
       Key words：YuJinFang;  Human embryonic lung fibroblast;  Anti-aging function
       随着人们生活水平的提高，青春常在成了人们的梦想。抗衰老的药物也随之不断地被研究出来。玉金方胶囊［1］是由CH3、海马、何首乌、黄精、猕猴桃等十几种名贵中药及生物抗氧化剂组成，是以中药为主西药为辅的复方制剂，主治因元气亏虚，肝肾不足所致的心悸、胸痹，用于动脉硬化，高脂血症，高血糖症及精力不足，老年斑，早衰等保健治疗。人胚肺成纤维细胞常用于研究细胞的衰老水平［2］。本文用人胚肺成纤维细胞，就玉金方抗衰老作用进行了体外实验研究。
       1  材料与仪器
       1.1  动物家兔，体重2.0～2.5 kg，由河南省实验动物中心提供。
       1.2  药物与试剂玉金方胶囊，规格0.25 g（由河南洛阳新春都生物制药有限公司提供，批号：061218），福康乐胶囊，规格每粒含盐酸普鲁卡因0.1 g，泛酸钙0.005 g（由上海新亚药业有限公司生产,批号：070130），人胚肺成纤维细胞（上海中科院细胞库提供），羧甲基纤维素钠，胎牛血清，链霉素，青霉素，α-MEM粉剂（美国Cellgro公司），胰蛋白酶、KCl，KH2PO4，NaCl，NaHCO3，Na2HPO4·7H2O，戊二醛，磷酸盐缓冲液（PBS），锇酸，丙酮，环氧树脂。
       1.2.1  培养液的制备α-MEM粉剂溶于三蒸水中，加链霉素100 μg/ml和青霉素100 μ/ml，用NaHCO3 调pH至7.2～7.4，最后加入15%胎牛血清。
       1.2.2  D-hank′s的制备KCl  0.4 g，KH2PO4  0.06 g，NaCl 8.0 g，NaHCO3  0.35 g，Na2HPO4·7H2O 0.06 g溶于1L三蒸水中。
       1.2.3  胰酶的制备0.25 g胰蛋白酶溶于100 ml D-hank’s液中。
       1.3  仪器低温离心机（德国SIGMA公司）、CO2恒温培养箱（艾拓思实验设备有限公司）、恒温水浴箱（杭州蓝天化验仪器厂），透射电子显微镜（日本日立公司）。
       2  方法
       2.1  含药血清的制备家兔24只，随机分为3组：空白对照组、阳性对照组（福康乐胶囊）、玉金方组，每组8只，雌雄各半，灌胃前12 h禁食不禁水。空白对照组以2 ml/kg 1%羧甲基纤维素钠灌胃，阳性对照组以0.82 g/kg·d 1％羧甲基纤维素钠灌胃，玉金方组以0.82 g/(kg·d)玉金方1%羧甲基纤维素钠制成的混悬液灌胃，1次/d，连续7 d，末次给药后2 h自耳静脉取血，3 000  r/min离心10 min后取血清，56℃灭活30 min，0.22 μm滤膜过滤除菌。
       2.2  细胞的传代将人胚肺成纤维细胞培养于α-MEM培养液中，置于37℃饱和CO2培养箱中培养。当细胞于瓶底壁长成致密单层，进行传代，传代时弃去旧液，用吹打管以0.25%胰蛋白酶消化液反复有规律地吹打瓶壁细胞，制成单个细胞悬液，以1∶2分种传代于两个培养瓶中，于37℃饱和CO2培养箱中培养。当细胞传至30代时，取9瓶，分为3组，分别为空白对照组、阳性对照组、玉金方组。空白对照组细胞的培养液不变；阳性对照组3瓶细胞培养液中分别加入最终浓度为20%，10%，5%的含福康乐的血清；玉金方组3瓶细胞培养液中分别加入最终浓度为20%，10%，5%的含玉金方的血清。观察细胞结构变化。
       2.3  透射电子显微镜的制片参照文献的方法［3］，将细胞置于4℃环境中，500 r/min离心6～8 min，收集5×106个细胞，将细胞用PBS洗2次。将细胞悬浮于2.5%戊二醛中，固定30 min，用PBS洗2次。将细胞悬浮于1%锇酸中，固定1h。配制50%，70%，80%，95%，100%丙酮，细胞从50%丙酮逐步移至100%丙酮，每次脱水15 min，100%丙酮脱水2次。再将细胞置于丙酮－包埋剂（1∶1）中室温置换1 h，然后用纯的包埋剂包埋在胶囊中，37℃过夜。次日升温至60℃，48 h固化。取出包埋块，切片。经醋酸双氧铀饱和水溶液染色30 min，蒸馏水漂洗，干燥。枸橼酸铅饱和水溶液染色15 min，双蒸水漂洗，0.02 mol/L NaOH分化，再用蒸馏水漂洗，干燥观察。
       3  结果
       3.1  细胞的传代数空白对照组细胞平均传64代，阳性对照组细胞平均传71代，玉金方组细胞平均传71.3代。阳性对照组比空白对照组多传7代，而玉金方组又比阳性对照组多传0.3代。结果见表1。表1  各组细胞传代数（略）
       3.2  细胞的形态学变化
       3.2.1  倒置显微镜观察30代人胚肺成纤维细胞生长迅速，细胞排列紧密，多呈放射状、编织状或漩涡状走行，有的交叉重叠生长。胞体呈长梭形或不规则三角形，胞质透明，突起短小，胞内颗粒少或未见，无空泡，胞膜清晰，细胞核呈椭圆形。3组细胞形态相差不大。而空白对照组细胞50代出现衰老现象，细胞排列不规则，体积较大，形状扁平，胞浆区域增大，胞质突起多而大，胞内出现颗粒和空泡，边界不清，形态不规则；55代成批的细胞出现固缩、脱落，有离壁漂起的现象。而阳性对照组和玉金方组则在60代出现衰老现象，65代左右出现成片固缩、脱落，离壁漂起的现象。
       3.2.2  透射电子显微镜观察空白对照组细胞30代时，胞核中核仁明显，可见常染色质，核膜周围有异染色质，胞浆中有粗面内质网、线粒体；50代时透射电镜显示细胞核质疏松，细胞浆内充满了大空泡，线粒体呈退行性变，有嵴线不能见到，粗面内质网少，溶酶体增多。而阳性对照组和玉金方组则在60代后出现空白对照组50代时的现象。
       4  讨论
       中医学认为人的生长、发育、衰老，主要与肾有密切关系，肾气旺则人体生命力强，健康少病，反之，生命力弱，早衰多病，因此，欲健康长寿，必先固护肾气，当发病之后更应固护肾气，方可达到延缓衰老之目的。而玉金方胶囊的主要成分有人参、海马、制何首乌、黄精、猕猴桃原汁干粉、VB1、VC、VE、复方CH3（盐酸普鲁卡因、苯甲酸、偏重亚硫酸钾、磷酸钙）。方中所用诸药，重在补肾填精，益气壮阳，可使肾气充实，元气旺盛，起到祛病延年的作用。方中复方CH3经多年临床观察，确有延缓衰老的作用。在中药为本的前提下，再配合确有成效的抗衰老药，补中药之不足。
       人胚肺成纤维细胞年轻时的细胞生长旺盛，细胞折光度好，立体感强，排列规则、整齐；衰老细胞园缩蜕变，折光度与立体感均差，排列不规则。福康乐胶囊与玉金方胶囊的传代数均比空白对照组传代数多，而且细胞衰老的各现象均比空白对照组迟缓。福康乐胶囊［4］（复方CH3）是经临床确认有抗衰老功能的。玉金方胶囊与福康乐胶囊抗细胞衰老作用相当。从细胞微细结构和传代数看，玉金方胶囊确有体外抗衰老的作用，为其临床应用提供了血清药理学的依据。
       【参考文献】
         　　［1］李 莉,张 娟,崔天祥,等.玉金方胶囊临床应用300例疗效分析［J］.中国基层医药, 2006, 13(4):606.
       
       ［2］高学军,蔡 霞,张 鹏，等.成纤维细胞体外培养过程中超微结构改变的观察［J］.潍坊医学院学报,2004,26（4）：259.
       
       ［3］张卓然.培养细胞学与细胞培养技术［M］.上海：上海科学技术出版社，2004:35.
       
       ［4］张洪泉.抗衰老药理学新论,第1版［M］.北京：人民卫生出版社,2004:419.