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       【摘要】 
       目的建立粉葛无菌苗培养及离体条件下诱导试管块根的体系。方法以粉葛的种子为外植体，MS培养基为基本培养基，培养条件为25℃， 2000～3000 Lx光照，12h/d。结果机械破坏种皮可有效地打破种子的休眠。除去顶芽有利于粉葛试管丛生芽的发生。已生根的试管苗转入块根诱导培养基中，根部明显增粗，形成粉葛的试管块根，最佳培养基配方为：MS+6-BA 2mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖5%。结论无菌离体条件下可以诱导出粉葛试管块根。
       【关键词】  粉葛 试管块根 诱导技术
       Research on the Induction Technology of the Tuberous Root of Pueraria thomsonii Benth.in the Test Tube
       ZHANG Fan, QI Jianjun, ZHOU Lili, QU Yanying, LI Xianen
       (1.College of Agronomy, Xinjiang Agricultural University, Urumqi, 830052, China; 2.China Union Medical College, The Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Science, Beijing 100094, China)
       Abstract:ObjectiveTo establish the sterilized seedling culture and the test tube earthnut induction system.MethodsThe seed of Pueraria thomsonii Benth.was cultured in MS culture medium as explant under the light length of 2000～3000Lx 12 h/d at 25℃. ResultsMechanical break could efficiently smash the dormancy of seed. The shearing away of the top sprout would contribute to the germination of fascicled bud. When the plantlet with induced roots were shifted to tuberous root inducing culture medium, the root obviously augmented which consequently led to the formation of test tube tuberous root. The optimized medium was MS+6-BA2mg/L+NAA 0.1 mg/L+sucrose 5%. ConclusionTest tube tuberous root of Pueraria thomsonii Benth.could be induced in sterile conditions in vitro.
       Key words:Pueraria thomsonii Benth.;  Test tube tuberous root;  Induction technology
       粉葛Pueraria thomsonii Benth.是豆科葛属多年生藤本植物，主产长江以南，在《神农本草经》《本草纲目》中均对其药用功效有记载。葛叶主金疮止血；葛花能解酒醒脾；葛谷（种子）治痢疾、解酒毒；葛根补心清肺、起阴气、解酒毒。其块根肥厚，富含淀粉和多种异黄酮类化合物。现代科学证明，葛根中的葛根黄酮，具有明显的抗凝血、抑制血小板聚集、降低血粘度、激活纤维蛋白酶等作用［1］。
       生产中粉葛多用无性繁殖。多年的无性繁殖，易导致种质退化，表现为：块根变细、产量降低、质量下降。目前，茎尖脱毒是防止病毒侵害、解决种质退化的常用方法［2］，而粉葛茎尖上耳片较多且密被绒毛，进行组织培养时材料消毒相对困难，要得到粉葛茎尖脱毒苗有存在一定难度；且脱毒苗繁殖系数小、成活率低、育苗周期长，运输极不方便，从而大大限制了在生产上的推广。近年来，马铃薯、半夏、地黄等作物均培养出了试管块根（块茎），试图尝试用试管块根来代替脱毒苗在生产中的应用。其中，试管马铃薯的培养技术日趋完善，完全可以代替试管苗作为商品供应［3］。目前，粉葛试管块根的研究国内外尚无报道，本研究开展了粉葛试管块根的诱导的研究工作。诱导粉葛试管块根的形成，也为粉葛的块根形成的机理研究提供材料。
       1  材料与方法
       1.1  材料湖南野生粉葛当年生的种子。
       1.2  方法
       1.2.1  培养基及培养条件选用MS基本培养基，蔗糖基本浓度为3%，用0.8%的琼脂固化，pH值为5.8～6.0，121℃湿热灭菌15 min，材料接种后置于光照培养箱中，培养条件为：25℃， 2000～3000 Lx光照，12 h/d。
       1.2.2  无菌苗的获得将粉葛种子用剪刀剪破种皮，用流水冲洗20 min，移入超净工作台上，用75%的酒精进行表面消毒30 s，再用0.1%的生汞对种子消毒10 min，无菌水冲洗5～6次，将消毒处理的种子置于装有湿润的双层滤纸的三角瓶中，在光照培养箱中培养10 h。10 h后将吸涨的种子取出用0.1%的生汞进行第2次消毒，消毒时间为6 min，无菌水冲洗5～6次后将再次消毒的种子分别移入1/2MS基本培养基，在光照培养箱中进行培养。
       1.2.3  幼苗的增殖培养待种子萌发的无菌苗长至2 cm左右时自根部切下，分别进行去除顶芽和不去顶芽两种处理后，移至MS+6-BA 2 mg/L+NAA 0.1 mg/L培养基中，在光照培养箱中进行幼苗的增殖培养。
       1.2.4  幼苗的生根当增殖培养的粉葛幼苗长至2～3 cm时，自幼苗基部切下，移至1/2MS+IBA 1 mg/L培养基中进行生根培养。
       1.2.5  粉葛试管块根的诱导当粉葛幼苗的根长至 1cm左右时，及时转入试管块根诱导培养基中进行粉葛试管块根的诱导培养。块根诱导培养基为：MS，MS+6-BA 1 mg/L+NAA 1.0 mg/L，MS+6-BA 2  mg/L+NAA 0.1 mg/L，MS+6-BA 2 mg/L+NAA 1.0 mg/L，MS+6-BA 3 mg/L+NAA 0.1 mg/L，其中蔗糖浓度均为5%。
       1.2.6  培养基不同蔗糖浓度对块根诱导的影响采用的基本培养基为： MS+6-BA 2 mg/L+NAA 0.1 mg/L，在基本培养基中分别加入不同的蔗糖浓度：3%，5%，8%和12%，将根长1 cm左右的粉葛试管幼苗移入上述培养基，观察不同蔗糖浓度对试管块根生长的影响。
       2  结果与分析
       2.1  无菌苗培养体系的建立由于粉葛种子具有休眠性，种子灭菌后直接移入发芽床中并不萌发，而采用机械破坏种皮的方法可有效地打破种子的休眠，种子的发芽率达到98.5%。另外，粉葛种子不易彻底消毒，经一次消毒的种子污染率高达85.4%，而两次消毒的方法可大大降低种子萌发时的污染率，使种子无菌萌发率达到45%以上。
       2.2  幼苗的增殖培养增殖培养15 d后两种处理的幼苗均长出丛生芽。去除顶芽的粉葛幼苗能长出约8个2 cm左右的丛生芽，未去除顶芽的粉葛幼苗萌发约为4个2 cm左右的丛生芽，实验证明除去顶芽有利于粉葛丛生芽的发生。
       2.3  植物激素对幼苗不定根增粗及块根形成的影响 带有不定根的幼苗移入块根诱导培养基，30 d后观察粉葛植株在各种培养基中的生长情况。结果表明：在空白MS培养基中培养的粉葛幼苗，30 d后根部继续伸长（5 cm左右），未见明显主根，根部没有增粗迹象，其直径小于0.1 cm；在生根培养基中生长的粉葛幼苗，根部继续伸长（8 cm左右），有明显主根，主根直径约为0.15 cm；在MS+6-BA 2 mg/L+NAA 0.1 mg/L培养基中，幼苗生出少量不定芽，根伸长不明显（2.5 cm左右），也不再长出新的不定根，但块根增粗明显，其直径可达到0.8 cm左右（图1）。当培养基中NAA浓度较高时，其植株基部愈伤化严重，幼苗趋于玻璃化，且其块根没有明显增粗现象。增大培养基中6-BA的浓度，幼苗易形成从生芽。因而诱导块根选择含有较低浓度的6-BA和NAA的培养基较为合适。
       2.4  培养基中蔗糖浓度对块根形成的影响带有不定根的幼苗移入不同蔗糖浓度的培养基中10d后观察发现，在蔗糖浓度为3％的培养基中，不定根增粗不明显，蔗糖浓度为5％和8%的培养基中可见块根明显增粗，在蔗糖浓度为8%的高糖含量培养基中，幼苗较矮小，叶片深绿，植株处于生长抑制状态。结果说明，较高的糖含量有利于粉葛块根的形成，但是含糖量过高对幼苗生长有抑制作用，而含糖5%的培养基较适合粉葛试管块根的形成。
       3  讨论
       粉葛种子具有休眠性，实验证明，采用机械破坏种皮是打破种子休眠的有效方法，说明粉葛种皮的不透气性和不透水性是影响粉葛种子萌发的主要原因。在生产上，人工除去顶芽用于消除顶端优势，可以促进侧芽生长、增加分枝数，本研究也证明除去顶芽有利于粉葛试管苗丛生芽的发生。
       目前，国内外对影响粉葛块根形成的因素及生理机制研究未见报道，对马铃薯块茎形成生理机制的研究表明，GA和ABA与马铃薯块茎形成有关，GA抑制块茎的形成，而ABA对块茎形成具有促进作用。块茎的形成也受到许多其它因素的影响，其中光照、温度及离体培养条件下的培养基中蔗糖浓度是块茎形成的主要影响因素［4］。本研究也证明了培养基高蔗糖浓度有利于粉葛试管块根的形成，GA、ABA对粉葛试管块根的作用和光照、温度对粉葛试管块根的影响还有待于进一步的研究。
       【参考文献】
         　　［1］冯瑞芝，陈碧珠.葛根的资源调查［J］.中国药学杂志，1993，28（5）：273.
       
       ［2］周维燕，刘青林，曹家树，等.植物细胞细胞工程原理与技术［J］.北京：中国农业大学出版社，2001：90.
       
       ［3］柳 俊，谢从华.马铃薯块茎发育机理及基因表达［J］.植物学通报，2001，18（5）：531.
       
       ［4］程龙军，郭得平，葛红娟.甘薯块根特异蛋白-Sporamin的研究进展［J］.植物学通报，2001，18（6）：672.