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       【关键词】  黄芩多糖
        摘要：目的：通过考察黄芩多糖对猪生殖和呼吸系统综合征病毒在传代细胞系MARC145细胞中增殖的影响，证明黄芩多糖具有抑制病毒增殖作用。方法：感染病毒的细胞用不同浓度的多糖样品处理，处理后继续培养若干小时，进行台盼蓝染色、免疫荧光分析、蚀斑形成实验和聚合酶链式反应。结果：随着黄芪多糖浓度的提高蚀斑形成数减少，感染病毒细胞的死亡率降低，荧光分析阳性率下降，聚合酶链式反应产物条带减弱甚至消失。结论：黄芩多糖显示细胞水平抑制病毒增殖作用。
        关键词：黄芩；  多糖；  抗病毒；  细胞培养
        Antiviral Effect of Polysaccharide from Scutellaria Baicalensis Georgi on Porcine Respiratory and Reproductive Syndrome Virus
        ZHANG Daoguang1, Jimmy Kwang2, PAN Shengi1*
        (1.School of Pharmacy, Fudan University, Shanghai 200032， China; 2.Temasek Life Sciences Laboratory, National University of Singapore)
        Abstract:Objective:To show that polysaccharide from Scutellaria baicalensis Georgi has antiviral property by investigating its effect on replication of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) in cells of the permanent MARC－145 cell line.Methods:Cells infected with virus were treated with various concentration of polysaccharide and incubated for some hours, then Trypan blue exclusive assay, immunofluorescence assay (IFA), plaque forming assay, polymerase chain reaction (PCR) was performed.Results:Number of plaques, the death rate of cells and percentage of IFA positive cells reduced and band of PCR product became weaker and undetectable with the concentration of polysaccharide increasing after infection with PRRSV. Conclusion:It was indicated that polysaccharide from Scutellaria baicalinsis Georgi could inhibit the replication of virus at cell level.
        Key words:Polysaccharide;  Scutellaria baicalensis;  Antivirus;  Cell culture
        黄芩始载于《神农本草经》，为唇形科多年草本植物黄芩(Scutellaria baicalensis Georgi)，根能清热燥湿，泻火解毒，止血安胎［1］。曾有报道黄芩苷有抑制病毒作用［2］，但黄芩多糖在细胞水平抗病毒作用未见报道。本研究在筛选抗病毒中药成分时首次发现黄芩多糖显示抑制猪生殖和呼吸系统综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, pRRSV)作用。PRRSV是20世纪80年代末出现的一种新病毒，属于动脉病毒科(Arteriviridae)，和非典型性肺炎(serious acute respiratory Syndrome, SARS)所属的冠状病毒科(Coromaviridae)组成新建立的尼多病毒目(Nidovirales)［3］，引起猪的生殖和呼吸系统综合症，该病以母猪的生殖障碍和仔猪的呼吸道症状和高死亡率为特征。近几年，随着非典型性肺炎和高致病性禽流感的出现，引起了人们对人畜共患疾病以及未在人类中传播的禽畜疾病的关注，黄芩多糖抗病毒作用再一次提示，中药在防治上述疾病中有很好的潜力。
           1  材料和方法
        1.1  材料
        1.1.1  细胞MARK－145永久细胞系由新加坡淡马锡生命科学实验室(Temasek life sciences laboratory)提供，细胞培养和维持的培养基是DMEM(Hyclone)，加入10%胎牛血清(Fetal Bovine Serum, Hyclone)，0.001 mol/L丙酮酸钠(Sodium Pyruvate, Hyclone)和10%的Antibioticantimycotic(10 000 u/ml青霉素G，10 000 μg/ml链霉素和25 μg/ml两性霉素的0.85%盐溶液(Gibco)。
        1.1.2  黄芩多糖黄芩150 g粉碎，过筛孔内径为4.699 mm筛(4目)，加入10倍量水中，水温90℃，煮沸3 h，提取3次，合并提取液，3 000 r/min离心10 min，收集上清液。用活性炭和硅藻土(1∶1)进行柱层析分离，收集乙醇∶水＝80∶20的流份，加入胰蛋白酶，25℃水解30 min，Savag法去蛋白，干燥，得到黄芩多糖。精确称取提取物，溶于0.01 mol/L磷酸盐平衡溶液(phosphate bufferd saline, PBS)，0.22 μm滤菌膜过滤，4℃储藏备用。
        1.1.3  病毒猪生殖和呼吸系统综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)由新加坡淡马锡生命科学实验室提供，纯化的病毒感染同一代的MARC145细胞，感染后4 d，冻融3次，0.22 μm滤菌膜过滤，本病毒所有实验均用此批病毒。
        1.2  方法
        1.2.1  黄芩多糖的细胞毒性实验在6孔培养板(NUNC)的每孔中均匀地种入106的细胞，各孔分别加入不同浓度黄芩多糖的培养基。每个浓度重复3个孔，细胞在培养箱内培养，96 h后，进行台盼蓝(Trypan blue solution, Sigma)排斥试验，测定各孔细胞的死亡率：用0.1%胰蛋白酶溶液消化细胞单层，消化后，加入不含酚红的MEM培养基(Gibco)，用移液管轻轻吹打几次，制得单个细胞悬液，取9滴细胞悬液滴入小离心管中，加入1滴0.4%台盼蓝溶液，3 min内，用血球计数板分别计数活细胞(未被染色)和死细胞(淡蓝色)，计算细胞的死亡率。
        1.2.2  黄芩多糖抑制PRRSV病毒蚀斑形成实验在6孔培养板(NUNC)的每孔中均匀种入106的细胞，培养24 h后，吸出培养液，0.01% mol/L PBS溶液洗涤1次。每孔加入100 μl 104倍稀释的PRRSV病毒溶液，37℃吸附1 h，吸出病毒液，加入含有不同浓度黄芩多糖、中性红和0.8%琼脂糖(Agarose, Bioline)的培养基(不含酚红)，避光培养到120 h，低倍光学显微镜下，计算可见的空斑数。每个浓度重复3个孔，另设3孔未感染病毒细胞和3孔感染病毒但加入不含样品的培养基，作为对照。
        1.2.3  黄芩多糖对抗病毒导致的细胞病变实验在6孔培养板上(NUNC)的每孔中均匀地种入106的细胞，按照1.2.2方法感染细胞，加入含不同浓度的培养基，继续培养96 h后，按黄芩多糖细胞毒性试验所述的台盼蓝排斥方法，计数各孔活细胞和死细胞，计算各孔细胞死亡率。
        1.2.4  黄芩多糖抑制病毒抗原合成实验在96孔培养板(NUNC)的每孔中均匀地种入104个细胞。按照1.2.2方法感染细胞，加入不同浓度的培养基，继续培养96 h后，行免疫荧光分析试验(Immunofluorescene Assay, IFA):吸去培养基，每孔加入100 μl纯乙醇，固定细胞30 min，吸干乙醇，用PBS－Tween溶液摇洗3次，5 min/次，吸干洗液。每孔加入5倍稀释的猪抗PRRSV阳性血清100 μl；或等量的猪抗PRRSV阴性血清，作为对照。放入37℃烘箱孵化60 min，吸出血清，按上述方法洗涤3次，加入50 μl稀释30倍的异硫氰酸荧光素标记的兔抗猪1 g(Rabbit/anti－Swine Imuminoglobulins/FITC, Dakocytomation)，铝箔纸包裹，37℃烘箱孵化40 min，按上述方法洗涤3次。观察各孔细胞的荧光情况。
        1.2.5  黄芩多糖对PRRSV病毒PCR产物的影响用6孔板，感染病毒量为每孔150 μl 104倍稀释的病毒液，按实验1.2.2的方法培养和感染细胞，加入含不同浓度的培养基，继续培养72 h，病毒的RNA用Trizol reagent (BRL)提取，以AMV酶合成cDNA，再以合成的cDNA为模板，引物为5’－AAGCTTAAGCTTGCCGCCGCCATGGCTCATCAGTGTGCAGCG3’，5’TCTAGATCTAGATTATCGTGATGTACTGGGGAGTG－3’。在Taq(Roche)酶作用下，Thermal cyclor (Perkin－Elmer Cetus 480)上经过30个循环：95℃持继40 s，58℃持续30 s，72℃持续30 s，紧接着，延长温度为72℃，持续10 min。PCR产物在1.0%的琼脂糖中100 V下电泳40 min，拍摄紫外灯下的条带。
           2  结果
        2.1  多糖的细胞毒性实验加入各种浓度的黄芩多糖的MARC－145细胞培养96 h后，浓度低于21 mg/ml的各孔细胞在倒置相差光学显微镜下观察，和未加多糖的各孔细胞形态上没有明显的差别。样品浓度25 mg/ml的3孔内可见胞质中出现空泡和颗粒样物质的细胞。台盼蓝排斥试验显示：多糖浓度低于21 mg/ml的各孔细胞死亡率均为(2%±0.3%)(±s，n=3，以下结果记录同)。当样品浓度为25 mg/ml时，细胞的死亡率为(29.7%±1.5%)。由于其他试验的浓度均低于5 mg/ml，而样品浓度低于21 mg/ml时未表现明显的细胞毒性，所以没有考察半数毒性浓度(50% toxicity dose,TC50)。
        2.2  多糖抑制PRRSV病毒蚀斑形成实验MARC145细胞感染PRRSV病毒96 h后，多糖浓度为2.5 mg/ml时，病毒形成的蚀斑数是感染病毒但未加多糖对照组蚀斑数的(84%±4%)，结果见表1。概率单位法计算得IE50=(3.14±0.09)mg/ml(P＜0.05)。
        表1  多糖抑制病毒的量效关系浓度/mg・ml（略）
        2.3  多糖对抗病毒导致的细胞病变实验感染病毒96 h后，感染PRRSV病毒未加多糖组细胞的死亡率为(59.6%±1.5%)，没有感染病毒的阴性对照组细胞的死亡率为(2.1%±0.2%)，当多糖浓度为2.5 mg/ml时，细胞死亡率为感染病毒但未加多糖处理(阳性对照)细胞死亡率的(79%±1.7%)，结果见表1。概率单位法计算得TE50=(3.00±0.04)mg/ml(P＜0.05)。
        2.4  多糖抑制PRRSV病毒ORF4和ORF5表达抗原实验通过免疫荧光分析显示，感染病毒未加多糖浓度低于5 mg/ml的各孔细胞，在荧光显微镜下，可见明亮的特异性的绿色荧光，荧光主要集中在细胞质近核膜区和细胞核内，而未感染病毒和感染病毒但多糖浓度高于5 mg/ml的各孔细胞未见特异性荧光(图1)。
        2.5  多糖对PRRSV病毒PCR产物的影响在紫外灯下，可以看出：在多糖浓度为2.0 mg/ml时，病毒复制的RNA，RTPCR产物条带比无多糖处理组的条带弱，当多糖浓度高于4.5 mg/ml时，病毒复制的RNA，RTPCR已经检测不到，显示多糖样品可以抑制病毒RNA的合成。(图2)。
        图2  各个处理组和对照组PCR产物电泳
           3  讨论
        利用合适的病毒细胞培养体系，采用蚀斑法(空斑减少法)，荧光抗体法，以细胞病变为指标，考察测试物对病毒增殖和病毒抗原的影响，是常用体外筛选抗病毒活性成分的手段之一，而本文通过上述各种方法和技术得到的结果首次为黄芩多糖直接抑制病毒提供了证据。实验中所用的细胞均为10～16代的MARC145细胞，病毒都是PRRSV在MARC145细胞增殖的第2代病毒，避免细胞和病毒的差异对实验结果的影响。黄芩多糖抑制PRRSV病毒的作用是本项目在筛选抗PRRSV病毒中药有效成分时，从100多种中药样品中发现的具有抗病毒作用的5种成分之一，其抗病毒作用未见报道。通常认为，黄酮类成分是黄芩的主要有效成分，并有抑制HTV的作用，但实验结果表明，黄酮类成分不能明显地抑制PRRSV病毒的增殖，而且细胞毒性较大。黄芩多糖抑制PRRSV病毒的机理，本课题组正在进行进一步的研究。
           参考文献：
        ［1］  国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社，2000：248249.
        ［2］  Katsuhiko K,Mitsuo H,Hitomi Y,et al.Baicalin,an inhibitor of HIV1 production in vitro［J］.Antivral Research,1998,37(2):131140.
        ［3］  Cavanagh D.Nidovirales:a new order comprising Coronaviridae and Arterivridae［J］.Arch.virol,1997,142(3):629633.
        基金项目：复旦大学与新加坡国立大学淡马锡生命科学实验室合作项目(No.03057)
        作者简介：张道广(1978)，男(汉族)，安徽庐江人，现为复旦大学药学院在读硕士研究生，主要从事中药抗病毒研究工作.
        通讯作者简介：潘胜利(1945)，男(汉族)，浙江镇海人，现任复旦大学药学院教授，硕士学位，主要从事药用植物资源及中药新药研究与开发工作.
        (1.复旦大学药学院，上海  200032； 2.新加坡国立大学淡马锡生命科学实验室，新加坡)