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       【关键词】  西洋参
        摘要：目的：建立西洋参中人参皂苷Rb1含量测定的现代分析方法，并对12种西洋参中的总皂苷及人参皂苷Rb1进行测定，以观察不同产地对其含量变化的影响。方法：人参总皂苷含量测定采用比色法，人参皂苷Rb1含量测定采用高效液相色谱法。结果：人参皂苷Rb1含量在62～1 230 μg・ml-1之间呈良好线性，平均回收率为99.2%（RSD=1.69%）。12种西洋参中，有10种西洋参所含人参总皂苷均大于4%，人参皂苷Rb1含量大于1%。结论：该法操作简便，快速，重现性好，结果准确，可作为西洋参质量控制方法。
        关键词：西洋参；总皂苷；人参皂苷Rb1；高效液相色谱法
        Determination and Comparison of the Contents of Total Ginsenoside and Ginsenoside Rb1 in Twelve Kinds of Panax quinquefolium. L
        CHEN Junhui, XIE Mingyong*, ZHANG Zhiming, FU Zhihong, NIE Shaoping
        (Key Laboratory of Food Science of Ministry of Education, Nanchang University, Nanchang 330047, China)
        Abstract:Objective:To develop a quick, convenient, modern analysis method for the determination of ginsenoside Rb1 in Panax quinquefolium L., to determine the contents of total ginsenoside and ginsenoside Rb1 of twelve samples and to compare the changes of the determined contents of samples origining from different regions.Methods:The contents of total ginsenoside were determined by UV-spectrophotometry, and the contents of ginsenoside Rb1 were determined by HPLC. Results:The calibration curve was linear over the concentration range of 62～123 0 μg・ml-1 for ginsenoside Rb1, the correlation coefficient was 0.999. The average recovery of the determination of ginsenoside Rb1 was 99.2% with the RSD of 1.69%. The contents of total ginsenoside of ten samples are more than 4%, while contents of ginsenoside Rb1 of ten samples are more than 1%.Conclusion:The developed method was found to be simple, fast, accurate and reliable for the determination of ginsenoside Rb1.
        Key words:Panax quinquefolium L.;Total ginsenoside;Ginsenoside Rb1;HPLC
        西洋参Panax quenquifolium.L又名西洋人参、洋参、花旗参、广东人参，为五加科植物。西洋参主产于美国、加拿大及法国，近年我国亦有栽培。西洋参味苦，性凉，入心、肺、肾经，功能以补益为主，可滋阴降火、益气生津［1］。药理实验结果表明，该生药的活性成分为西洋参皂苷。研究表明，西洋参皂苷有抗动脉粥样硬化的作用，不同剂量的西洋参都能够降低血脂和血清过氧化酶的活性，保护急性心肌梗死的心肌细胞；西洋参皂苷还有抗疲劳、增强记忆和提高学习能力的作用［1］。国内外对西洋参皂苷的测定基本同人参皂苷，多以比色法、薄层光密度法、薄层扫描法、高效液相色谱法测定［2］。本文采用比色法，对不同产地西洋参中的总皂苷进行测定比较；并建立了一种测定西洋参中人参皂苷Rb1含量的高效液相色谱法，对12种西洋参中的人参皂苷Rb1进行测定和比较。
           1仪器与材料
        1.1仪器UV-2000紫外分光光度计（尤尼柯公司）；FA1104电子天平（上海精天电子仪器厂）；电子恒温不锈钢水浴锅（上海宏兴机械仪器实业制造公司）；旋转蒸发器（上海荣生有限公司）；TDL-5型离心沉淀机（上海飞鸽系列离心机厂）；超声波发生器（上海声源超声波仪器设备有限公司的SY3200超声波清洗器）；高效液相色谱仪:Waters公司515二元高压梯度系统，515泵，2487紫外检测器，PCM泵控制器，Millennium 32色谱工作软件，柱温箱，手动进样器 (20 μl定量环)。
        1.2试剂与药品人参皂苷对照品由中国药品生物制品检定所提供（含量测定用），批号：Rb1 704-200115 Re 0784-200217；香兰素（中国医药集团上海化学试剂公司）；乙腈（HPLC级试剂，美国Fisher公司）；甲醇（HPLC级试剂，上海陆都化学试剂厂）；水（重蒸水）；正丁醇（分析纯，上海豪申化学试剂有限公司）；浓硫酸（分析纯，上海实验试剂有限公司）。HPLC用所有试剂均经过0.45 μm微孔滤膜过滤及超声脱气处理。
        1.3样品西洋参根共12个样品(经江西中医学院药剂师罗光明鉴定为西洋参),其中8个为东北吉林样品（8号样品为长枝参、7号样品为短枝参）、2个为新加坡样品（1号样品为长枝参、2号样品为短枝参）、1个为加拿大样品（西洋参切片生产剩下的西洋参碎片）、1个为广州样品。
           2方法与结果
        2.1人参总皂苷的测定
        2.1.1标准曲线的绘制［3］精密称量人参皂苷Re对照品16.3 mg，置于10 ml容量瓶中，加入甲醇至刻度，摇匀，即得。分别精密量取人参皂苷Re标准品溶液10，20，40，60，80，100 μl于具塞试管中，用甲醇定容到1 ml，配成系列对照溶液。分别准确加入0.5 ml 8%的香兰素乙醇溶液 (用无水乙醇现配)，5 ml 77%的硫酸溶液，混合均匀，置于60℃水浴上恒温10 min，然后立即取出，放入冰水浴15 min，取出放置至室温，显色溶液于544 nm处测定吸光度，以吸光度(A)对人参皂苷浓度(C)作回归处理，得回归方程:C=0.230 5A-0.004 5,r=0.999。结果表明，人参皂苷Re在16.3～163 μg范围内吸光度与浓度呈良好的线性关系。
        2.1.2供试品溶液的制备［4］精密称取西洋参干燥粉（40目）2 g，包入滤纸中，置于100 ml烧杯中，加乙醚60 ml，于超声波提取器中脱脂15 min，取出晾干，待乙醚挥尽，加80%的甲醇水溶液超声波法提取4次(50，40，40，40 ml)，提取30 min/次。合并各次提取液抽滤，滤液真空浓缩至干，加蒸馏水溶解残渣，并用蒸馏水洗涤容器数次，合并各次洗液(约30 ml)，置于分液漏斗中，用正丁醇萃取4次(正丁醇分别为20，20，15，15 ml)，合并各次正丁醇萃取液，转移到分液漏斗中，用20 ml蒸馏水洗涤合并液，洗涤后正丁醇液真空浓缩至干，残渣加甲醇溶解并转移至50 ml容量瓶中，用甲醇多次洗涤容器，洗液并入容量瓶中，加甲醇至刻度摇匀即为待测液。
        2.1.3西洋参总皂苷的含量测定精密量取待测液50 μl，置于10 ml具塞试管中，其余步骤同标准曲线的制备。在544 nm波长处测得吸光度，由标准曲线计算出供试品溶液中总皂苷的含量。测定结果见表1。
        表1样品测定结果%样品（略）
        2.2人参皂苷Rb1的测定
        2.2.1色谱条件参考有关文献资料［5～7］并对方法进行改进，对西洋参中人参皂苷Rb1的含量测定进行试验研究，确定色谱条件为：色谱柱为Alltima C18 (250 mm×4.6 mm,5 μm)柱, 流动相为乙腈:水=34：66，流速为1.0 ml/min，检测波长为203 nm，柱温为35℃，进样量为20 μl，理论板数按人参皂苷Rb1峰计算不得低于4000。
        2.2.2对照品溶液的制备精密称取人参皂苷Rb1对照品12.3 mg，置于10 ml容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得。
        2.2.3供试品液相色谱分离情况按2.2.1色谱条件测定，比较人参皂苷Rb1标准品溶液及供试品溶液色谱图（见图1，图2），可以看出在实验条件下色谱峰分离良好。
        图1西洋参标准品HPLC图谱图2西洋参样品HPLC图谱
        2.2.4标准曲线的绘制分别精密吸取上述对照品溶液0.05，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 ml，加入甲醇稀释至1 ml，摇匀，得浓度为0.062，0.123，0.246，0.492，0.738，0.984，1.23 mg・ml-1的对照品溶液，精密吸取对照品溶液25 μl，按2.2.1色谱条件分别进样，测定人参皂苷Rb1峰面积，以人参皂苷Rb1峰面积为横坐标，对照品浓度（mg・ml-1）为纵坐标，绘制标准曲线，求得回归方程：C=0.186 7E-6×A-0.002 2，r=0.999 7，人参皂苷Rb1含量在0.062～1.23 mg・ml-1之间呈良好线性关系。
        2.2.5精密度实验精密吸取对照品溶液（0.467 mg・ml-1）25 μl，按2.2.1液相色谱条件，重复进样6次，测定人参皂苷Rb1峰面积，结果表明，其测定值相对标准偏差RSD为0.29%，说明本方法精密度良好。
        2.2.6稳定性实验精密吸取供试品溶液25 μl，按2.2.1液相色谱条件，每隔一定时间进样1次，结果供试品溶液中人参皂苷在8 h内峰面积无明显变化，其测定值相对标准偏差RSD为0.51%，说明供试品溶液在8 h内其化学性质非常稳定。
        2.2.7重现性实验精密称取样品适量，按2.1.2处理方法将其制成供试品溶液，按2.2.1液相色谱条件，将供试品溶液重复测定5次，人参皂苷Rb1平均含量为251.1 μg・ml-1，RSD为0.30%，说明本法测定重现性良好。
        2.2.8回收率实验精密称取西洋参干燥粉（40目）2.0 g，按2.1.2处理方法将其制成供试品溶液，精密吸取对照品溶液（0.467 mg・ml-1）和供试品溶液各1 ml，置于具塞比色管中摇匀，取一定量混合液适当稀释，按2.2.1液相色谱条件测定加样回收率，测定结果见表2。结果表明，本法回收率高，测定结果准确，方法可行。
        表2样品加样回收率实验结果编号  (略)
        2.2.9人参皂苷Rb1的含量测定取不同产地的西洋参，按2.1.2处理方法将其制备成供试品溶液，按2.2.1液相色谱条件，测定12种西洋参样品中人参皂苷Rb1的含量，结果同列表1。
           3讨论
        3.1人参总皂苷测定方法评价对中药中与其功效相吻合的主要活性成分进行定量分析，以评价其质量是中药现代化及中药走向世界的关键问题之一。西洋参中人参皂苷是其主要生物活性物质，是衡量西洋参质量的重要指标。文献［8］报道中多以人参总皂苷为西洋参质量衡量指标。本文采用经典的比色法对12种西洋参中总皂苷含量进行测定，其测定结果的标准偏差RSD值均小于3%，表明该法测定总皂苷的结果可信度较高。
        3.2人参皂苷Rb1测定方法评价《中国药典》［9］以人参皂苷Rb1的含量为西洋参质量衡量标准，采用HPLC法控制西洋参质量。在该色谱条件下，试验结果表明人参皂苷Rb1保留时间过长。本文在该基础上进行改进，建立了一种测定西洋参中人参皂苷Rb1含量的RP-HPLC方法，在拟定的色谱条件下，人参皂苷Rb1的色谱峰与其它干扰组分能快速、有效分离，且测定方法的精密度、重现性及线性关系良好，回收率令人满意。结果表明，本文色谱条件优于中国药典的推荐条件，可参考作为西洋参质量的快速控制方法。
        3.312种西洋参中总皂苷与人参皂苷Rb1含量比较中药最讲究原产地，不同产地的中药材其主要化学成分基本一致，但其活性成分含量会有一定差异。从12种西洋参样品的西洋参皂苷含量测定结果来看（表1），产地批次不同，西洋参总皂苷和人参皂苷Rb1含量有一定差异，且西洋参总皂苷含量的多少与人参皂苷Rb1的含量基本呈正对应关系。如果是粗略评价西洋参质量，则可采用单一指标进行评估，但是西洋参总皂苷的含量与人参皂苷Rb1的含量并不是完全对应，故需要精确评估西洋参质量还需采用双指标法。皂苷只是西洋参最主要的活性成分之一，采用皂苷含量作为西洋参质量控制标准只能反映西洋参质量的一个方面，目前一致认为［10］，西洋参多糖对机体具有较好的免疫增强作用，而且这种作用甚至强于西洋参皂苷，笔者认为西洋参多糖含量也可作为西洋参质量评估的标准之一。实验结果表明，12种西洋参中总皂苷含量在2.8%～7.7%范围内，其平均含量为5.7%，RSD为28.3%；人参皂苷Rb1含量在0.53%～2.97%之间，其平均含量为2.10%，RSD为41.4%。可以看出所测12种西洋参中大部分的总皂苷及人参皂苷Rb1含量较高，其中有10种西洋参中总皂苷含量大于4%，符合《中成药质量标准与标准物质研究》［11］拟定的西洋参质量标准，人参皂苷Rb1含量在1.0%以上，符合《中国药典》的要求。另外2种西洋参无论是总皂苷还是人参皂苷Rb1都没达到国家质量标准的要求，可能是因为采集到的西洋参是此两产地的劣质参。从实验结果还可以得出吉林产区的西洋参质量相对较好，与文献［12］报道一致。新加坡产的长枝参人参皂苷Rb1含量较高，而短枝参总皂苷含量较高，因此无法确定哪种参质量更优，有文献［13］报道，长枝、短枝西洋参其内在品质并没有明显差异。加拿大产西洋参无论总皂苷含量还是人参皂苷Rb1含量都与我国吉林产西洋参相差不大，说明国产西洋参质量并不比北美产西洋参质量差，甚至还优于进口西洋参。西洋参活性成分的含量与其产地的经纬度、日光照射时间、无霜期、降水量、土壤特性以及西洋参的采收季节、采集年限、干燥方法、保存方法等密切相关。至于西洋参皂苷含量与这些条件之间的关系以及总皂苷与人参皂苷Rb1之间的关系问题，还有待进一步研究确定。
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        (南昌大学食品科学教育部重点实验室，江西 南昌330047)