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       【摘要】 
       目的研究大孔吸附树脂分离纯化翻白草中总黄酮的工艺条件。方法比较AB-8，NKA，NKA-9，D-152，D-101，ADS-17等6种大孔吸附树脂对翻白草总黄酮的静态解吸率。结果D-101型树脂对翻白草中总黄酮有最好的吸附分离性能。D-101型大孔树脂分离纯化翻白草黄酮的最佳工艺条件为:柱体积为160 ml, 翻白草提取物上样量为62.5 mg/ml(以湿树脂体积计),先用pH 4的蒸馏水淋洗,再用30%的乙醇洗脱,洗脱剂用量为2.5～3倍湿树脂体积。结论D-101型树脂是分离纯化翻白草黄酮的适宜大孔树脂，纯度超过60%，此工艺可行。
       【关键词】  翻白草 总黄酮 大孔吸附树脂 分离 纯化
       大孔吸附树脂是一类有机高聚物吸附剂,近年来被广泛应用于天然产物的分离［1］。根据其孔径，比表面积构成类型分为许多类型。翻白草为蔷薇科委陵菜属多年生草本植物［2］，主要成分为乌苏酸和大量的黄酮类化合物。近年来，翻白草更多的药用价值被发现，民间流行用翻白草治疗糖尿病并取得不错的疗效。翻白草醋酸乙酯萃取物有较强的降血糖作用，能调血脂、清除自由基、抑菌等，且毒性极小。翻白草的主要药理活性成分为黄酮类物质［3～5］。近年来有关翻白草中黄酮类的测定与分析时有报道［6～7］，但是尚未见采用大孔树脂分离纯化翻白草中总黄酮的系统报道，故本实验对AB-8，NKA，NKA-9，D-152，D-101，ADS-17等6种树脂进行筛选，旨在探索适合分离纯化翻白草中总黄酮类物质的最佳大孔树脂及纯化的最佳工艺。最终筛选得到对翻白草中总黄酮有最好的吸附分离性能树脂，且分离和纯化翻白草中黄酮类成分(以翻白草总黄酮为主)纯度达到62.48%,为纯化翻白草提取物奠定了基础。
       1  仪器与试药
           
       752p紫外分光光度仪（上海光谱仪器有限公司）；AL104电子天平（Mettler -Toledo仪器公司）；KQ-500DE型医用超声波清洗机（昆山超声仪器有限公司）；DF-101B集热恒温磁力搅拌器（浙江乐清市乐成电器厂）；TDZ5—WSD多管架自动平衡离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）；超声波提取仪（北京宏详隆仪器有限公司）；旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）。树脂（天津市海光化工有限公司）；乙醇、硝酸铝、亚硝酸钠、氢氧化钠，均为分析纯。
        
       材料采集于湖南怀化市溆浦县，经鉴定为蔷薇科委陵菜属多年生草本植物翻白草。
       2  方法
       2.1  翻白草供试液的制备 
       
       翻白草粉以4倍量的70%乙醇在超声波功率为610 W超声波循环提取45 min,过滤，减压浓缩回收乙醇，静置冰箱过夜，过滤除去叶绿素备用。
       2.2  标准曲线的制备
       精密称取在120℃减压干燥至恒重的芦丁对照品10.00 mg，置于50 ml的容量瓶中，加95%的乙醇30 ml，置于水浴上微热溶解，放冷，加乙醇稀释至刻度，摇匀，即为浓度为0.2 mg/ml的芦丁标准品溶液。精密量取已制备的对照品溶液0，0.5，1.0，2.0，3.0，4.0 ml，分别置于10 ml具塞试管中，加1.0 ml亚硝酸钠(1：20)溶液，混匀，放置6 min，加0.5 ml硝酸铝(1：10)溶液,混匀，放置6 min，加1 mol/L的氢氧化钠4 ml，再加水至刻度，摇匀，放置15 min，用分光光度法在λ＝500 nm处测定吸光度，用最小二乘法作线性回归得芦丁浓度（Y）与吸光度（X）的关系曲线的回归方程式：Y＝0.8577X-0.0005 ，R2＝0.999 2。
       2.3  大孔树脂的处理
       将AB-8，NKA，NKA-9，D-152，D-101，ADS-17大孔树脂依次用2倍体积5%NaOH水溶液浸泡24h，1倍体积蒸馏水，2倍体积10%盐酸洗涤，最后用蒸馏水洗至中性。以乙醇湿法装柱，用93%乙醇在柱上流动淋洗，不时检查流出的乙醇液，至乙醇液与水混合(1∶5)无白色浑浊为止，然后以大量蒸馏水洗去乙醇。
       2.4  大孔树脂的筛选 
       将浓度为50 mg/ml的翻白草提取物水溶液分别通过6种不同型号的已预处理好的树脂柱，进行动态吸附。用1%FeCl3检查流出液,待反应呈阳性(检测显色)时，表明已有黄酮流出,树脂吸附达饱和，停止上样,记录上柱量，计算总黄酮吸附量，单位为mg/ml。上样后的树脂柱先用水洗至无色并用浓硫酸检测至无糖反应，再用93%乙醇洗脱至洗脱液无色止。将乙醇洗脱液蒸干、称重、测定总黄酮含量、计算总黄酮回收率。总黄酮吸附量及总黄酮回收率分别按公式(1)和(2)计算:A=BV(1)R=(ET)×100(2)
        
       式中 A:总黄酮吸附量（mg/ml）；B:被树脂吸附的黄酮总量（mg）；V:湿柱体积（ml）；R:总黄酮回收率（%）；E:93%乙醇洗脱液中黄酮总量（mg）；T:上柱总黄酮量（mg）。
       2.5  D-101大孔树脂柱纯化翻白草黄酮类化合物工艺的确定
       2.5.1  上柱条件的确定分别称取5.07，10.01，15.17，20.53 g粗提物,溶于50 ml水中，上柱(柱体积为160 ml)，吸附30 min后，先用大量水淋洗，直到洗脱液无色并用浓硫酸检测不出糖为止，然后用93%的酒精洗脱至AlCl3检测呈阴性(不显色)，收集洗脱液,测总黄酮含量和回收率。
       2.5.2  淋洗pH值的确定称取10 g粗提物，溶于50 ml水中，上柱后，分别用不同pH值的水充分淋洗，直到用浓硫酸检测无糖反应为止，再用93%的酒精洗脱，直到用1%FeCl3检测不显色为止，收集洗脱液，测总黄酮含量和回收率。
       2.5.3  洗脱条件的确定
        
       洗脱剂的确定：称取10 g粗提物，溶于50 ml水中，上柱后先用大量水淋洗至淋洗液无色并用浓硫酸检测不出糖，然后分别用30%，50%，70%，93%的乙醇洗脱,将乙醇洗脱液分别蒸干、称重、测定总黄酮含量、计算总黄酮回收率。
        
       洗脱剂pH值对翻白草黄酮纯化效果的影响：称取10 g粗提物,溶于50 ml水中，上柱后，先用水充分淋洗,至淋洗液无色并用浓硫酸检测不出糖为止，然后用pH值分别为2，3，4，5和6的93%的乙醇洗脱，至5%FeCl3检测不显色为止，将乙醇洗脱液分别蒸干、称重、测定总黄酮含量、计算总黄酮回收率。
         　　
       洗脱曲线的考察：按前面所确定的吸附、洗脱条件,取翻白草提取液上柱、吸附、洗脱(柱体积为160 ml),每100 ml收集一次,共收集7份,分别测吸光度值,据此绘制洗脱曲线。
       3  结果
       3.1  大孔树脂的筛选大孔树脂由于其理化性质不同对吸附分离的影响很大。由于树脂极性、孔径、比表面积、孔容等不同,故性质不同。在所选择的6种大孔树脂中,NKA和NKA-9为极性,AB-8为弱极性,ADS-17为中等极性,D-101和D-152为弱酸性阳离子交换树脂。
       由表1可知,D-101型大孔树脂分离纯化翻白草总黄酮效果较好，总黄酮吸附量最高,这是因为翻白草黄酮是一种弱极性物质，在弱极性柱上更容易吸附，同时可能是因为比表面积较大的原因，也较容易洗脱,纯化后总黄酮含量最高，总黄酮回收率也较高，故确定D-101树脂为分离纯化翻白草黄酮的最佳树脂。表1  6种大孔树脂对翻白草黄酮的吸附分离性能比较（略）
       3.2  D-101树脂纯化翻白草黄酮的工艺
       3.2.1  上柱量的确定结果见表2。
       
       由表2可知,当柱体积为160 ml,粗提物上柱量为10.01 g，纯化后虽然纯化后总黄酮含量略低于上柱量为5.07 g，但总黄酮回收率最高。继续增加上柱量，由于吸附不完全，纯化后总黄酮含量和回收率都明显降低。考虑到纯化效率,粗提物上样浓度以62.5mg/ml湿树脂为宜。表2  不同上柱量对D-101大孔树脂分离纯化翻白草黄酮的影响（略）
       3.2.2  淋洗pH值的确定翻白草提取物中含有大量的水溶杂质如色素，可溶性糖等，因此样品上柱后先用水淋洗可除去极性较大的色素和糖等。
       由图1可知，淋洗液的pH值对翻白草黄酮纯化效果有一定的影响。当pH值从2增大到4时，总黄酮回收率增大，当pH值大于4时总黄酮回收率减小，以pH 4效果最理想。实验中还发现,酸性水溶液能加快去杂和脱糖，这可能与提取物中糖的种类和性质有关。
       3.2.3  洗脱条件的确定乙醇浓度对D-101大孔树脂纯化翻白草黄酮的影响结果见表3。表3  乙醇浓度对D-101大孔树脂纯化翻白草黄酮的影响（略）
       由表3可知乙醇浓度对D-101大孔树脂纯化翻白草黄酮有较大的影响，用93%乙醇洗脱总黄酮回收率最大，达72.60%，但由于93%的乙醇也能将其它杂质一起洗脱下来，致使醇洗物中黄酮含量仅为17.22%。用30%乙醇洗脱可能由于解吸不完全的原因,虽然总黄酮回收率较低，但醇洗物中总黄酮的含量最大，达到39.67%。综合考虑以30%乙醇作洗脱剂较为适宜。
        
       洗脱液pH值对D-101大孔树脂纯化翻白草黄酮的影响：结果见表4。表4  洗脱液pH值对D-101大孔树脂纯化翻白草黄酮的影响（略）
       从表4可以看出,洗脱液pH值对D-101树脂纯化翻白草黄酮的影响不大，对纯化后总黄酮含量及回收率影响甚微，经统计分析无显著差异，因此，洗脱剂无须调pH值。
        
       洗脱曲线的考察：由图2可见,第5份洗脱液吸光度显著减小，表明此部分洗脱液中黄酮含量很低,绝大多数黄酮在前4份已被洗脱下来，从经济和效率考虑，第5份后可不予收集，只收集前4份，即收集400 ml,故洗脱剂用量定为2.5～3倍湿树脂体积。
       
       4  讨论
           
       D-101大孔树脂对翻白草具有良好的吸附性能，用来纯化翻白草黄酮是可行的。
        
       D-101分离纯化翻白草总黄酮的最佳条件为：柱体积为160 ml, 翻白草提取物上样量为62.5 mg/ml(以湿树脂体积计)，先用pH 4的水淋洗，再用30%的乙醇洗脱,洗脱剂用量为2.5～3倍湿树脂体积。D-101大孔树脂按上述确定的吸附洗脱条件可重复使用3次。翻白草黄酮经上述工艺纯化后总黄酮纯度达到52.43%。大孔树脂色谱是吸附原理和分子筛原理相结合的新的色谱方法，其吸附力以分子间范德华力为主；其分子筛作用是由于其多孔性结构所决定。与传统的除杂方法和工艺相比，大孔树脂吸附分离技术具有可使提取的有效成分高度富集，杂质少，缩小剂量。大孔树脂吸附分离技术作为一项新的技术，在国外已广泛被使用，在我国也日益引起高度重视。与传统的提取技术和分离技术相比，大孔树脂吸附分离技术以其独特的优势(所得提取物体积小、不吸潮、容易制成外形美观的各种剂型)在生产研究中越来越被广泛地使用，它是对提取工艺影响最大、带动面最广的技术之一［8］。
       【参考文献】
         　　［1］马振山.大孔吸附树脂在药学领域中的研究应用［J］.中成药，1997,19（12）:40.
       
       ［2］国家药典委员会.中国药典［S］. 北京：化学工业出版社，1986:2705.
       
       ［3］黄芸,秦民坚,余国奠.异黄酮类化合物在植物界的分布及药理作用［J］.中国野生植物资源,2001,20(1):5.
       
       ［4］Sanchez I,Gomez-Garibay F,Taboada1 J,et al.Antiv raleffect of flavonoids on the denguevirus［J］. Phytotheapy Research, 2000 , 4：89.
       
       ［5］王琦，周玲仙，罗晓东，等.翻白草不同方法提取物对小鼠降血糖作用［J］.中国公共卫生，2007,23(2):225.
       
       ［6］张俭，伍贤进，谭运兰，等.翻白草营养成分及部分药用成分的测定与分析［J］.食品科技，2006，9:238.
       
       ［7］孟令云，杨 玲，王佳祥，等.翻白草中黄酮类化合物的液相色谱分析［J］.中草药，2005， 36（3）：445.
       
       ［8］宫健伟，叶 蕾.大孔树脂在中草药及复方提取分离中的应用进展［J］.甘肃中医,2007,20(4):55.