文章标题 全文   多个检索词，请用空格间隔。

       【摘要】 
       目的初步探讨何首乌提取物聚酰胺柱层析流分对人脐静脉血管内皮细胞增殖的影响。方法MTT比色法检测何首乌提取物聚酰胺柱层析流分对人脐静脉血管内皮细胞生长的促进作用；HE染色法观察其流分对人脐静脉血管内皮细胞形态学的影响。结果经聚酰胺柱层析洗脱的何首乌流分对人脐静脉血管内皮细胞增殖具有不同的作用，其中D流分随着浓度的增加，对人脐静脉血管内皮细胞增殖具有促进作用，显微镜下观察到细胞的数量及分裂相增多，B和C流分对细胞的增殖影响不大，而A流分对血管内皮细胞具有抑制生长作用，细胞的数量减少，核固缩。结论何首乌提取物聚酰胺柱层析流分中含有促人脐静脉血管内皮细胞生长的活性物质。
       【关键词】  何首乌 聚酰胺柱色谱 人脐静脉血管内皮细胞 MTT比色法 HE染色法
       Study on the Promoting Effect on Human Umbilical Vein Vascular Endothelial Cells Proliferation Activity of the Fractions Isolated from Polygonum Multiflorm Thunb Extracted with Polyamide Column Chromatography
       ZHAO Fang, HOU Huaxin*, HUANG Yingyu
       (Guangxi Medical University, Nanning 530021, China)
       Abstract:ObjectiveTo investigate the proliferation effects on human umbilical vein vascular endothelial cells(HUVECs)of the fractions isolated from Polygonum multiflorm Thunb extracted with polyamide column chromatography. MethodsThe activity of promoting HUVECs growth of each fraction was observed by MTT colorimetric assay. The changes of HUVECs morphology were observed by HE stain. ResultsThe fractions eluted from polyamide column chromatography had different proliferation activities on HUVECs. With the increase of concentration，the fraction D could promote the growth and proliferation of HUVECs significantly. The cells showed morphological change significantly under microscope. Compared with the control，the cell quantity and mitosis of the fraction D were increased. However, there was little or no effects on the proliferation of HUVECs by fraction B and C. In contrast, fraction A had an inhibitory effect on the growth of HUVECs , which caused the decrease in the cell number and karyopycnosis. ConclusionThere are some components of promotion growth of HUVECs in the fraction from polygonum multiflorm Thunb.
       Key words: Polygonum multiflorm Thunb.；  Polyamide column chromatography；  Human umbilical vein vascular endothelial cell(HUVEC)；  MTT colorimetric assay；  HE stain
        
       何首乌Polygonum multiflorm Thunb.系蓼科植物何首乌的干燥块根，具有乌须发、悦颜色、补肝肾、抗衰老之良效［1］。现代药理学研究表明其醇提或水提液具有提高免疫力、抑制血小板聚集、舒张血管、抗氧化等作用，且这些作用与其中的活性成分二苯乙烯苷（2,3,5,4＇-tetrahydroxy-stilbene-2-O-β-D-glucoside）有关［1，2］。二苯乙烯苷又称芪多酚，属多羟基芪类化合物，现代药理学研究表明，其具有清除自由基［2］、降低胆固醇［3］、保护肝脏等［4］作用。本实验采用MTT法和HE染色法观察何首乌提取物聚酰胺柱层析流分对人脐静脉血管内皮细胞增殖的影响，为何首乌的进一步开发和利用提供依据。
       1  材料与仪器
       1.1  材料
       聚酰胺（60～80目）和聚酰胺薄膜（10 cm×10 cm）购于浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂；何首乌饮片购自广西医药公司；人脐静脉血管内皮细胞购自武汉大学保藏中心。
       1.2  仪器
       RE-52型旋转蒸发仪(上海博通)；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；紫外线检出器(日本)；二氧化碳培养箱(Thermo Forma MODEL 3111)；Σ960酶标仪；倒置相差荧光显微镜（Olympus CXZIFSZ）；生物显微镜（日本Olympus）。
       1.3  试剂乙醇；丙酮；甲醇(成都市科龙化工)；冰乙酸(上海实意化学试剂有限公司)；无水乙醇(重庆川江化工)；氯仿(广东省化学试剂工程技术研究开发中心),以上试剂级别均为分析纯。RPMI1640培养基（GIBCO Invitrogen cooperation）；新生牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)。
        
       自配试剂 ：2%三氯化铁-2%铁氰化钾显色剂；0.5%胰蛋白酶溶液；PBS；苏木精染液；伊红染液及1%稀盐酸乙醇溶液。
       2  方法
       2.1  何首乌流分提取分离取2 kg何首乌粉用4倍量70%乙醇回流提取，浓缩后的总浸膏依次采用环己烷、醋酸乙酯、正丁醇分别进行萃取。采用聚酰胺柱层析法，以蒸馏水-乙醇为洗脱剂对正丁醇层浸膏进行分离，收集各流分；点样，在365 nm处用紫外灯观察，并以2%三氯化铁-2%铁氰化钾显色跟踪检测，合并相同流分，减压浓缩。按洗脱顺序分别得到A，B，C，D流分组。
       2.2  活性研究
       2.2.1  细胞的培养人脐静脉血管内皮细胞培养于含体积分数为10%热灭活新生牛血清的培养液中，置二氧化碳培养箱，在37℃，5％CO2条件下培养。
       2.2.2  MTT法测定细胞生长增殖实验取指数生长期细胞用0.5%胰蛋白酶消化,加入含小牛血清的培养液计数并稀释至1×104个/ml。将稀释的细胞悬液按100 μl/孔接种至96孔板,置37℃,5%CO2培养箱中孵育24 h至细胞贴壁后,选择A，B，C，D 4种流分，每组设5个浓度梯度加入至96孔板中,每个浓度设3个平行孔。同时设PBS空白对照组6孔，继续培养72 h,取出孔板，每孔加入20 μl 5 mg/ml的MTT,37℃、5%CO2条件下孵育4 h,弃尽孔内液,每孔中加入200 μl的DMSO溶解MTT产物。振荡30 s，用酶标仪于490 nm处测定每个孔的吸光值A值。计算存活率：细胞存活率(%)=(用药组平均A值/对照组平均A值)×100%
       2.2.3  HE染色法观察流分对人脐静脉血管内皮细胞形态的影响取贴壁生长的细胞，用0.5%胰蛋白酶消化,加入含小牛血清的培养液计数并稀释至1×104个/ml。 将稀释的细胞悬液按2 ml/孔接种至6孔板，加入已高压灭菌的盖玻片，培养24 h后，加入不同浓度的流分，药物组设定如下：A流分组、D流分组，每组设两个浓度梯度，每个浓度设2个平行孔；同时设2孔空白对照组。培养24 h后，取出盖玻片。用95％乙醇固定，苏木精及伊红染色，乙醇脱水，二甲苯透明，最后用中性树胶封片,摄像。
       3  结果
       3.1  MTT实验结果不同浓度的流分分别作用于人脐静脉血管内皮细胞后，采用MTT法测定其对细胞生长的作用。其中流分D对人脐静脉血管内皮细胞的生长具有促进作用，出现明显的量效关系，即浓度越高，存活率越高。流分A对人脐静脉血管内皮细胞具有一定的抑制生长作用。流分B，C与对照组比较，基本无差异。结果见表1。
       表1  何首乌提取物4种流分对人脐静脉血管内皮细胞生长的作用(略)
       3.2  细胞形态学改变经HE染色后显微镜观察，可见正常的人脐静脉血管内皮细胞呈梭形，细胞浆丰富，均匀，细胞核规则，呈紫蓝色，核内染色均一。A流分组对细胞具有抑制作用，光镜下观察到细胞的数量减少，部分细胞特别是高浓度组出现胞浆减少，核固缩现象。D流分组对细胞具有明显的促进生长作用，尤其是高浓度组表现为细胞生长旺盛，核分裂相增多，细胞数量增多。见图1。
       4  讨论
           
       聚酰胺是通过己内酰胺聚合而成的尼龙-6（锦纶、卡普隆）及由己二酸与己二胺聚合而成的尼龙-66，是一种白色多孔非晶型粉末，其分子中含有丰富的酰胺基，可与多酚类化合物的羟基（或羧基）形成分子间氢键而将其吸附。分子中酚羟基数目越多，芳香化程度越高的化合物与酰胺基的结合力越强，从而实现与其它物质的分离［5］。结合本文MTT法结果可以知道，较晚洗脱出来的流分D，对人脐静脉血管内皮细胞具有促进增殖生长作用，推测流分D中促进血管内皮细胞生长的物质可能与含有酚羟基数目较多有关。但要确定酚羟基是否为促人脐静脉血管内皮细胞生长的药效团有待进一步研究。
        
       血管内皮细胞在维持血管张力和血流调节方面发挥重要作用，内皮细胞还可以阻止血小板和白细胞的激活，所以完整的内皮系统在维持血管稳定和防止血栓方面发挥重要作用。临床实践证实中药何首乌提取物对生物体多种代谢活性具有积极的影响作用。本实验结果表明，在何首乌醇提物的正丁醇萃取物中含有对血管内皮细胞增殖产生促进作用的活性物质，可使细胞的分裂相增多，染色质丰富，为进一步从何首乌中分离纯化具有保护和修复血管内皮细胞的活性物质提供了依据。
       【参考文献】
         　　［1］李玉芳,何玄华.何首乌现代研究进展［J］.中成药,1997,19(5):37.
       
       ［2］Ryu G，Ju JH，Park YJ,et al. The radical scavenging effects of stilbene glucosides from Polygonum multiflorum［J］.Arch Pharm Res，2002，25(5):636.
       
       ［3］Arichi H, Kimura Y, Okuda H,et al. Effects of stilbene components of the roots of Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc. on lipid metabolism［J］.Chem Pharm Bull (Tokyo). 1982 ，30(5):1766
       
       ［4］Kimura Y, Ohminami H, Okuda H., et al.Effects of stilbene components of the roots of polygonum Spp.On liver injury in peroxidized oil-fed rats［J］.Planta Med，1983，49(9):51
       
       ［5］斐月湖.天然药物化学实验，第4版［M］.北京：人民卫生出版社，2005：39，54.