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       【摘要】 
       目的从DNA水平对收集的4个产地的刺五加进行遗传多样性分析，为更好地开发利用刺五加资源奠定基础。方法随机扩增多态性DNA（RAPD）技术分析遗传多样性，UPGMA进行聚类分析。结果10个随机引物扩增得到72条片段，多态性位点比率为88.89％。不同产地间的遗传相似系数在0.469 3～0.785 1之间，均值为0.629 3，同一产地不同居群间的遗传相似系数在0.563 0～0.954 2之间，均值为0.764 4。不同产地刺五加之间的遗传多样性高于同一产地不同居群的个体，其中产地穆棱的刺五加与产地和龙、本溪、尚志之间的相似性较低，单成一支。产地之间的相似性与地理距离呈不完全相关性。结论刺五加种群内部具有较高的遗传多样性，利用RAPD技术分析刺五加的遗传多样性是可行的。
       【关键词】  刺五加 遗传多样性 扩增多态性DNA
       Genetic Diversity of Eleutherococcus senticosus by RAPD Analysis
       XING Zhaobin,  LAO Fengyun, WU Peng, LI Yuyan,SHEN Hailong
       1.Department of Biology, North China Coal Medical College, Tangshan 063000, China;
       2.School of Forestry, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China
       Abstract：Objective In order to develop and utilize the resource of Eleutherococcus senticosus ,the genetic diversity of Eleutherococcus senticosus from four habitats were analyzed by RAPD analysis. MethodsRAPD was used to analyze the genetic similarity,then cluster analysis was carried out by UPGMA method.ResultsTen random primers generated 72 bands (rate of polymorphic bands was 88.89%). The genetic similarity index among different habitats were 0.469 3～0.785 1 (the mean value was 0.629 3), while the genetic similarity index among different populations of Eleutherococcus senticosus from the same habitat were 0.563 0～0.954 2 (the mean value was 0.764 4). The cluster analysis showed that the genetic diversity of Eleutherococcus senticosus from different habitats was higher than that of Eleutherococcus senticosus from different populations grown in the same habitat and the similarity of Eleutherococcus senticosus from Muling separated with that from other habitats from Helong, Benxi and Shangzhi. The results also showed that the similarity among habitats was partly in agreement with the geographic distance. ConclusionThe genetic diversity were high in the population of Eleutherococcus senticosus,so it is feasible to analyze the genetic diversity of Eleutherococcus senticosus from different habitats by RAPD.
       Key words：Eleutherococcus senticosus;  Genetic diversity;   RAPD
       
       刺五加Eleutherococcus senticosus是我国医药珍品，根、茎、叶均可入药。历代本草医药记载，其有益气健脾、补肾安神之功效，已载入《中国药典》（1977年版）。自20世纪70年代末以来以刺五加为原料生产的各种制剂和饮料等产品远销国外，因而使刺五加资源消耗与日俱增。在自然状态下刺五加有性生殖能力弱、无性繁殖困难，1992年出版的《中国植物红皮书》已把刺五加列为了渐危物种［1］。
        
       珍稀物种多样性保护的中心环节是遗传多样性的保护，同时丰富的遗传多样性也是道地药材研究、种植与优良品种选育的基础。国内外已有从同工酶［2］、等位酶［3］水平上对刺五遗传多样性的研究。但同工酶和等位酶是从蛋白水平上反映生物的遗传变异，而蛋白质仅反映了基因可编码序列的状况，不能全面分析整个基因组的遗传多样性特点［4］。RAPD分析技术是在PCR的基础上发展起来的随机扩增的DNA多态性分析，具有多态性高、快速、简便、无需预先了解所研究物种的基因组结构等特点，在很多物种种下水平遗传多样性的检测、种间、属间遗传关系的讨论以及遗传图谱的构建等方面发挥了重要的作用。为了研究不同产地刺五加间的遗传多样性，我们选取了4个产地的野生刺五加进行了RAPD分析。
       1  材料和方法
       1.1  植物材料植物材料来源见表1。材料采集后移植于华北煤炭医学院校园内（海拔20 m），并进行日常管理与维护。表1  植物材料来源（略）
       1.2  总DNA的提取利用Tiangen公司植物基因组DNA提取试剂盒提取新鲜叶片的基因组DNA，将准备好的DNA溶于适量的TE缓冲液，用分光光度法测定DNA的浓度和纯度，并将其调整为20 μg/μl。
       1.3  RAPD产物及检测从40个RAPD随机引物中选取了10个多态性高、重复性好的引物(见表2)，在4个产地10个居群间进行PCR扩增。反应体系如下：25 μl体系中包括模板DNA 100 ng，引物100 ng，Taq酶1 U，含(NH4)2SO4的10×buffer 2.5 μl［750 mmol/L Tris-HCl （pH 8.8），200 mmol/L (NH4)2SO4，0.1% Tween 20）］，25 mmol/L的 MgCl2 2.5 μl，在PTC-100TM PCR仪上进行，程序如下：94℃预变性2  min，然后进行以下40个循环：94℃ 30 s，40℃ 30 s，72℃ 1 min，最后72℃延伸5 min。反应产物在1.5％琼脂糖胶上检测，电压4V/cm，电泳50 min，用BIO-RAD Gel Doc 2000凝胶成像系统记录拍照。用λDNA HindⅢ作分子量对照。表2  所用引物及扩增结果（略）
       1.4  数据分析利用Cross Checker软件，按琼脂糖凝胶同一位置上DNA电泳条带的有无进行统计，有带的标记为“1”，无带的标记为“0”，获得1、0数据矩阵。应用POPGENE32软件进行UPGMA（Pair group method using arithmetic）聚类分析。
       2  结果
       2.1  刺五加遗传多样性分析结果从40个随机引物（10碱基的寡核苷酸）中筛选出的10个能得到清晰扩增谱带且产生多态性的随机引物进行PCR扩增。共扩增出72个可区分的位点，主要集中在200～2 000 bp之间，其中64个表现出多态性，多态性比例高达88.89％，平均每个引物产生7.2个位点，其中多态性位点6.4个。4个产地刺五加的多态性位点比例大小依次为：尚志>和龙>本溪>穆棱（见表3）。扩增结果见图1。
       
       由Nei指数估算的基因多样性结果与多态性位点比例大小顺序相同（见表3）。由POPGENE32算出的总居群基因多样度（Ht）、居群内基因多样度（Hs）和基因分化系数（Gst）在4个产地10居群上分别为：0.452 9，0.179 4，0.603 9；在产地和龙7个居群上分别为：0.359 4，0.195 7，0.455 5。表3  4产地刺五加的遗传多样性（略）
       不同产地刺五加间的平均遗传相似系数为0.629 3。产地和龙（吉林省延边地区）与产地穆棱（黑龙江省牡丹江地区）、本溪（辽宁省）、尚志（黑龙江省哈尔滨地区）之间的平均遗传相似系数分别为：0.469 3，0.753 2，0.785 1，产地穆棱与产地本溪、尚志间的遗传相似系数分别为：0.571 0，0.517 7，产地本溪与产地尚志之间的遗传相似系数为0.679 7（见表4）。以产地和龙的7个居群为试材研究了同一产地不同居群刺五加的RAPD遗传多样性。结果表明，其平均遗传相似系数为0.764 4，最小值为0.563 0，最大值为0.954 2。见表4。表4  4产地刺五加的相似系数与遗传距离矩阵（略）
       P01-P10为供试样品编号同表1；斜线上方为遗传相似系数，下方为遗传距离。
       2.2   聚类分析UPGMA聚类见图2。聚类图上产地穆棱的刺五加单成一支，与其他3个产地之间的相似性较低；和龙、本溪、尚志3产地刺五加之间的相似性较高，其中产地本溪又单成一支与另两产地之间相似性较低；而产地和龙的7个居群共为一支。
       3  讨论
           
       由于地理位置不同，所处的气候、环境条件之间存在差异，导致植物在适应不同的环境过程中积累和保存的变异(基因突变) 产生差异，在生态环境和内在遗传变异的长期作用下产生遗传分化，形成不同的居群。植物居群在形态、等位酶和DNA 等不同水平上随地理距离的遗传分化，已被许多研究者发现［2～4］。另一方面，一些个体从一个群体迁移到另一个群体就会把某些基因带到新的群体，从而产生基因流动。基因流增加了群体内部的遗传多样性［5］。分布在长白山主脉和其支脉张广才岭的尚志、穆棱、和龙和本溪4个地区的刺五加10个居群，地理位置不同、海拔高度不一、生态环境差异较大，各居群出现了明显的遗传分化。多态性位点比例（88.89％），各产地间、同一产地不同居群间的遗传距离（0.6293、0.7644）和聚类分析的结果均表明，刺五加不同产地、同一产地不同居群间存在较大的遗传分化。这与前人［6～8］的RAPD分析结果是一致的。
       由产地水平和同一产地不同居群水平的Gst可知：在产地水平上，总变异中的39.61％来自于产地内的变异，产地间的变异占总变异的大部分（61.39％）；在同一产地不同居群水平上，总变异中的54.45％来自居群内部的变异，居群间的变异（45.55％）略低于居群内变异。刺五加是兼有无性繁殖和异花传粉的有性繁殖物种［1］，在产地水平上，产地间的变异占总变异的大部分，在同一产地不同居群水平上，居群间变异略低于居群内，同时聚类分析的结果表明刺五加的遗传相似系数与地理距离间没有显著的相关性。表明在小地域范围内（同一产地不同居群间），刺五加各居群间可通过花粉、种子传播等主要基因交流方式实现基因的交流，而在大地域范围内，由于地理距离较远，通过花粉和种子的重力传播可能性不大，而鸟类也很少采食刺五加的果实，致使不同产地间生态环境造成的产地间的变异超过产地内部的变异比例。   
       同功酶分析结果表明，同一产地的3种花丝长度刺五加的遗传距离在0.059～0.091之间［2］，本实验中的结果为0.045 8～0.437 0；Zhou等［3］利用等位酶分析了5产地刺五加的遗传多样性，结果表明多态性位点比例、基因分化系数和平均遗传距离上分别为：26.9％，0.385和0.047，均显著低于本实验中的结果。RAPD分析和等位酶标记都被广泛地用来研究物种的遗传多样性，然而，由于等位酶和同功酶其本身是编码区不易发生变异，采用等位酶和同功酶标记很可能揭示出偏少的多态位点，而RAPD扩增的区域为整个基因组，其中基因组非编码区的变异速度较快，因此，用RAPD检测到的遗传多样性往往比等位酶高［4，9］。
       【参考文献】
         　　［1］邢朝斌, 沈海龙, 赵丽娜, 等. 刺五加的体细胞胚胎发生研究［J］.中草药, 2006,37(5):769.
       
       ［2］孙中武, 祝 宁, 高瑞馨, 等. 刺五加的同工酶与遗传分化的研究［J］.东北林业大学学报，1999,27(2):27.
       
       ［3］Zhou S L，Wen J，Hong D Y. Allozyme diversity in Eleutherococcus senticosus and E. brachypus from china and its implication for conservation［J］. SIDA，2004,21(2):993.
       
       ［4］Esselman E J，Li J Q，Crawford D，et al. Clonal diversity in the rare calamagrostis porteri ssp. Insperata (Poaceae): comparative results for allozymes and random amplified polymorphic DNA (RAPD) and intersimplc sequence repeat (ISSR) markers［J］.Molecular Ecology，1999，8(3):443.
       
       ［5］Thormann C E，Ferreira M E，Camargo L E，et al. Comparison of RFLP and RAPD Markers to Estimating Genetic Relationships Within and Among Cruciferous Species［J］.Theor Appl Genet，1994,88(8):973.
       
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