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       【摘要】 
       目的找出能代表牡丹皮活血化淤作用的高效液相色谱（HPLC）药效指纹图谱。方法将牡丹皮不同提取部位样品进行小鼠活血化淤实验研究，同时进行HPLC分析，获得牡丹皮不同提取部位的指纹图谱，然后运用数理统计软件分析药效指标与指纹图谱相关信息之间的关系。结果确定以甲醇提取部位的HPLC图谱来制定牡丹皮的药效指纹图谱。结论应用该方法制定得到的指纹图谱更具有实用价值，而且更为科学、合理。
       【关键词】  牡丹皮 活血化淤 高效液相色谱 药效指纹图谱
       Studies on the Pharmacodynamic Fingerprint of Cortex Moutan
       ZHOU Liyan, LIANG Shengwang, WANG Shumei ，WU Mingxia，CHEN Chunyan
       1. Guangdong College of Pharmacology，Guangzhou，510006，China；
       2.Henan College of Traditional Chinese Medicine，Zhengzhou 450008，China
       Abstract：ObjectiveTo find out the Pharmacodynamic Fingerprint which can represent the action of activating blood circulation to dissipate blood stasis. MethodsTaking the samples of different parts for the study of activating blood circulation to dissipate blood stasis, at the same time, taking them for the study of HPLC to gain the fingerprints of different parts，and then the correlation between the pharmacological indexes and the information of the HPLC fingerprint was discovered by the statistic software. ResultsThe fingerprint of the methanol part could represent the Pharmacodynamic Fingerprint of Cortex Moutan.ConclusionThe fingerprint established by this method not only represents the chemistry information but also reflects its validity, it makes the study of fingerprint more scientific and reasonable.
       Key words：Cortex Moutan ;   Activating blood circulation to dissipate blood stasis;   HPLC;   Pharmacodynamic Fingerprint
       
       牡丹皮是一常用中药，收载于历版《中国药典》，本品为毛茛科芍药属植物牡丹Paeonia suffruticosa Andr.的根皮，具有清热凉血、活血化淤之功效［1］ 。牡丹皮中所含的主要有效成分为酚类（如丹皮酚）、萜类、苷类（如芍药苷）、鞣质等。2005年版《中国药典》对牡丹皮的质量控制仅局限于对丹皮酚一种成分的薄层鉴别和含量测定，不能全面反映牡丹皮的内在质量。姜潇等［2］ 采用HPLC色谱线性梯度洗脱程序，建立了可供鉴别牡丹皮药材的高效液相指纹图谱，这些均是化学信息，不能反映药物的有效性，即所得图谱并不一定能用来控制牡丹皮的有效性。本研究采用不同极性溶剂对牡丹皮进行提取，将其不同提取部位样品进行小鼠活血化淤实验研究，同时进行HPLC分析，获得牡丹皮不同提取部位的指纹图谱，然后运用数理统计软件，找出了与药效成正相关的色谱峰并制定出能代表牡丹皮有效性的HPLC指纹图谱。
       1  仪器与试药
          
       2010A高效液相色谱仪（日本岛津）；KQ3200DE型医用数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；SOUTH990全自动血液流变分析仪（重庆南方医疗设备公司）。
        
       丹皮酚对照品（中国药品生物制品检定所，批号110708-200306）；乙腈为色谱纯；甲醇等试剂均为分析纯；水为娃哈哈纯净水；昆明种小鼠［雄性（20±2）g，购于河南省动物实验中心］；牡丹皮（采自河南省洛阳市土桥村）。
       2  方法与结果
       2.1  药理实验研究
       2.1.1  样品溶液的制备
        
       水部位：取牡丹皮粗粉适量，加水浸泡30 min，然后煎煮15 min，放凉，滤过，滤液浓缩至0.3 g药材/ml的溶液，备用。
        
       其它部位：取牡丹皮粗粉适量，分别加甲醇、醋酸乙酯、乙醚加热回流提取1 h，加入正丁醇超声提取30 min，放凉，滤过，得到各单一溶剂提取部位，再将各部位以相当于药材的量1∶1两两混合（包括水部位），滤液减压回收溶剂至干，加0.5％CMC-Na溶液制成0.3 g药材/ml的混悬液，备用。
        
       共得到15个不同提取部位的样品溶液。
       2.1.2  小鼠活血化淤实验研究取昆明种小鼠180只［雄性，（20 ±2）g］，随机分成18组，每组10只，分别为15个提取部位的有效剂量组（0.4 ml/只）、模型对照组（0.5％CMC-Na溶液）、阳性对照组（尼莫地平0.4 mg/只）和空白对照组（0.5％CMC-Na溶液）。连续以有效剂量灌服16 d，除空白对照组外，其余各组均同时每天后腿肌肉注射地塞米松磷酸钠注射液0.2 ml(16 μg/ml),于第16天给药1 h后，摘除双侧眼球取血，置加有肝素钠的离心管中，充分振摇，测定全血粘度。
       2.2  HPLC指纹图谱研究
       2.2.1  供试品溶液的制备
        
       水部位：取牡丹皮粗粉0.2 g，精密称定，置烧杯中，精密加入水50 ml，称重，浸泡30 min，然后煎煮15 min，取出，放冷，称重，用水补足减失的重量，滤过。精密量取续液5 ml，水浴40℃蒸干，加甲醇定容至5 ml，0.45 μm滤膜滤过，即得。
        
       其它部位：取牡丹皮粗粉0.2 g，精密称定，置于烧瓶中，分别精密加入甲醇、正丁醇、醋酸乙酯、乙醚各50 ml，称重，水浴加热回流提取1 h（正丁醇部位超声提取30 min），取出，放凉，称重，用相应溶剂补足减失的重量，滤过，精密量取续滤液5 ml，水浴40℃蒸干，用甲醇定容至5 ml，0.45 μm滤膜滤过，即得单味溶剂供试品溶液。将上述提取液分别精密量取5 ml两两混合（包括水部位），于水浴40℃蒸干，加甲醇定容至10 ml，0.45 μm滤膜滤过，即得各混合溶剂供试品溶液。
        
       共得到15个不同提取部位的样品溶液。
       2.2.2  丹皮酚对照品溶液的制备  精密称取丹皮酚对照品适量，加甲醇配制成浓度为59.2 μg/ml的对照品溶液。
       2.2.3  色谱条件色谱柱为Hypersil ODS 色谱柱(4.6 mm×250    mm，5 μm)；柱温30℃ ；流动相0～30 min，乙腈10～15%，0.5%冰醋酸90%～85%；30～60 min，乙腈15%～50%，0.5%冰醋酸85%～50%；流速1.0 ml·min-1；λs=274 nm和239 nm；进样量10 μl。
       2.2.4 方法学考察
        
       精密度实验：取同一供试品溶液（甲醇提取部位），连续进样5次，考察色谱峰的相对保留时间、峰面积比值的一致性。结果表明，RSD<3%，符合指纹图谱的技术要求。
        
       重复性实验：取牡丹皮甲醇提取溶液5份，依法测定。结果表明色谱峰的相对保留时间和峰面积的比值RSD<3%，符合指纹图谱的技术要求。
        
       稳定性实验：取同一供试品溶液（甲醇提取部位），分别在0，2，4，6，8，10，12 h检测。结果表明，其色谱峰的相对保留时间和峰面积的比值基本没有明显变化，RSD<3%，说明供试品溶液在12 h内稳定。
       2.2.5  样品HPLC分析精密吸取供试品溶液和对照品溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，按照上述色谱条件进行检测，记录60 min的色谱峰，即得。以丹皮酚色谱峰（s峰）的保留时间及峰面积为1，计算各共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积的比值。并制备10批样品不同提取部位的供试品溶液，分别建立不同提取部位的指纹图谱。
       2.2.6  相对保留值指纹图谱的建立［3］相对保留值α的计算 选择峰面积较大,各样品均存在的丹皮酚的色谱峰为参照峰,其α值为1,求出样品所有峰的相对保留值α。α=ｔRi"/ｔRa"(ｔRi"-各组分的调整保留时间,ｔRa"-丹皮酚的调整保留时间）
        
       指纹谱的建立 Rs为各峰与参照物的峰面积比值，以衡量样品中各成分相对含量稳定情况，以评价样品中成分的稳定性。Rs＝i峰的面积值/s参照物峰面积值 ×100％。
        
       根据样品的HPLC图谱，计算相对保留时间α和相对峰面积比值Rs，凡是α值相同或相近（误差<1%）的峰即可认为是同一化合物峰。将各个样品每个峰的Rs值列在相应的α值项下，其α值项下无相应峰的样品，其Rs值计为0，这样,由α值和Rs 值组成15个部位样品的HPLC相对保留值指纹谱。
       2.3  药理实验结果与指纹图谱相关性研究 
       2.3.1  原则首先波长的选择应该使药理效果好的部位有最佳的分离度和灵敏度，而且在此波长下还要求与药理效果成正相关的峰最多，总峰面积最大，使有效峰的峰面积占总峰面积的比例最大，这样才能将牡丹皮有效性的信息最大限度地反映在指纹图谱上。
       2.3.2 方法
       将小鼠活血化淤的药理实验结果与牡丹皮各提取部位的HPLC图谱α-Rs数据进行相关性分析，以全血黏度的平均值为Y值，以各提取部位的HPLC图谱Rs数据为X值，并按照出峰顺序表示为X1，X2，X3……，分别进行逐步回归分析。
       2.3.3 结果
       在274 nm波长处的HPLC图谱中共分离得到9个色谱峰，其Rs数据与药理试验数据结合所建立的回归方程中有8个变量作用显著被保留，其中有7个变量与活血化淤作用成正相关，分别为X1，X2，X3，X6，X7，X8，X9，其中色谱峰X9为丹皮酚，X6为芍药苷，有1个变量与活血化淤作用成负相关，为X4，另外有1个变量与活血化淤作用无关，为X5，所得回归方程为Y=6.263 18-8.005 88X1-8.077 08X2-0.866 59X3+1.785 34X4-0.206 44X6-7.832 24X7-1.224 74X8-0.726 36X9（Y：药效指标，X：色谱峰）；
        
       在239 nm波长处的HPLC图谱中共分离得到11个色谱峰，其Rs数据与药理实验结果所建立的回归方程中有9个变量作用显著被保留，其中有6个变量与活血化淤作用成正相关,分别为X1，X3，X4，X6，X8，X11，其中色谱峰X11是丹皮酚，X6为芍药苷，有3个变量与活血化淤作用成负相关，分别为X7，X9，X10,另外的2个变量与活血化瘀作用无关，分别为X2，X5，回归方程为：Y=6.474 85-2.427 48X1-0.483 64X3-0.388 42X4-0.262 62X6+0.899 16X7-0.470 38X8+0.631 19X9+1.528 63X10-1.730 22X11（Y：药效指标，X：色谱峰）
       2.3.4  牡丹皮药效指纹图谱的建立由不同波长下不同提取部位的指纹图谱数据可知，甲醇部位HPLC图谱含有与活血化淤活性成正相关的峰最多，而且峰面积之和最大，分离度较好。在274 nm波长处的甲醇HPLC图谱中与活血化淤作用成正相关的色谱峰有7个，分别是X1，X2，X3，X6，X7，X8，X9，由10批样品的指纹图谱可知有效峰的峰面积占色谱图总峰面积的均值为60.53%，而239nm波长处的甲醇部位HPLC图谱中与活血化瘀作用成正相关的色谱峰有6个，分别是X1，X3，X4，X6，X8，X11，10批样品指纹图谱中有效峰的峰面积占色谱图总峰面积的均值为41.65%，根据“2.3.1”项下指定的原则，选用274 nm波长处的甲醇提取部位的指纹图谱来建立牡丹皮的“药效指纹图谱”，见图1。10批样品的叠加图谱见图2。并用甲醇部位有效峰的相对峰积来建立牡丹皮的相对保留值“药效指纹图谱”。见表1。表1  10批样品不同相对保留时间（α）的相对峰面积比值（Rs）（略）
        
       各色谱峰的分离度R≥1.8，有效理论塔板数以丹皮酚计不低于5 000。
       3 讨论
           
       本实验仅选择了测定全血黏度来代表其活血化淤作用有失偏颇，如果再增加一些活血化淤的不同机理的实验研究，如测定对血液流变性的影响、凝血时间、凝血酶时间、血浆复钙时间等的测定，或者再增加抗炎、降血糖、镇痛等方面的药效学实验，再与指纹图谱的相关信息进行处理、分析，得出的结果则会更加全面、合理、科学。
       3.1  流动相的选择牡丹皮中所含成分复杂，使用单一流动相各色谱峰很难达到理想的分离效果，实验中我们考察了不同组成、不同比例及不同洗脱梯度的流动相的分离效果，结果表明现在所采用的流动相分离效果较好。
       3.2  最佳检测窗口的选择本实验采用的是二极管阵列检测器，采用上述所得最佳流动相条件运行样品，可以看到在任意波长下色谱峰的分离情况，通过观察发现在λ＝274 nm处，样品中丹皮酚有最大吸收且各色谱峰分离较好，多数峰的灵敏度都比较高，但是峰数较少且芍药苷的峰灵敏度较低；又发现λ＝239 nm处，样品中色谱峰数增多且各色谱峰同样分离较好，总峰面积较大，芍药苷峰的灵敏度提高。通过将指纹图谱与药理结果相结合，确定牡丹皮药效指纹图谱的最佳检测窗口为274 nm，选择的原则是与药效成正相关的峰最多，而且分离度较好，有效峰面积占总峰面积比例最大。这样得到的指纹图谱更能代表牡丹皮的有效性。
       【参考文献】
         　　［1］国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社,2005：119.
       
       ［2］姜潇,张君仁. 牡丹皮HPLC指纹图谱的研究［J］.齐鲁药事,2005,24（4）：209.
       
       ［3］洪筱坤,王智华.中药数字化色谱指纹谱［M］.上海：上海科学技术出版社，2003：74.