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       【摘要】 
       目的探讨中华眼镜蛇毒（Chinese cobra venom）对体外培养的人类小涎腺腺样囊性癌(NACC)细胞株诱导凋亡的作用。方法应用三磷酸腺苷-生物荧光肿瘤化疗药物敏感实验法（ATP-TCA）测定细胞的生长抑制百分率，倒置相差显微镜、HE染色观察细胞形态学改变，流式细胞仪分析细胞周期及细胞凋亡率。结果ATP-TCA实验显示眼镜蛇毒对体外培养的NACC细胞生长有明显的抑制作用，与浓度和作用时间呈正比；形态学观察发现用药后的NACC细胞质空泡、核固缩、核染色质聚集等形态学变化现象；流式细胞仪检测发现眼镜蛇毒阻滞NACC细胞生长于细胞周期的G0／G1期，检测到实验组细胞凋亡率显著高于对照组。结论中华眼镜蛇毒能抑制NACC细胞增殖，诱导NACC细胞凋亡。
       【关键词】  中华眼镜蛇毒 NACC细胞株 细胞周期 细胞凋亡
       Effects of Chinese Cobra Venom on Proliferation and Cell Cycle of Noovel Human Palatal Salivary Gland Cells Line of Adenoid Cystic Carcinoma
       LIU Chengjun，WEI Shixiu，LI Muyan，WU Hua，LI Jiaquan
       1.Jiangbin Hospital of Guangxi，Nanning 530021, China;
       2. Experiment Center of Medical Science, Guangxi Medical University，Nanning 530021, China
       Abstract：Objective To study on the effect of Chinese cobra venom-induced apoptosis in Noovel Human palatal salivary gland cells line. MethodsThe adenosine triphospate(ATP)-bioluminescence tumor chemosensitivity assay (ATP-TCA) was used to examine the growth of NACC cells treated with Chinese cobra venom in different concentration.Cell apoptosis was observed by flow cytometry and cell morphology. ResultsThe experiment showed that cobra venom could obviously inhibit the growth of NACC cell in a concentration and time-dependent manner.The changes in morphology of NACC Cell were observed by HE staining. The flow cytometry analysis showed that apoptosis and inhibition of NACC cells in the G0/G1 phase were induced after treated with Chinese cobra venom. The apoptotic rates of NACC cells treated with Chinese cobra venom groups were significantly higher than that in control group. ConclusionCobra venom can inhibit proliferation and induce apoptosis of NACC cells.
       Key words：Chinese cobra venom;    NACC cell;   Cell cycle;  Cell apoptosis
       
       涎腺腺样囊性癌是最常见的涎腺恶性肿瘤之一，研究有效药物控制其复发和转移成为目前研究的热点。中华眼镜蛇毒中成分复杂，其主要成分有神经毒素、细胞毒素、酶、蛋白质及多肽等。具有多方面的药理作用，如抗炎、抗血小板聚集、镇痛、抗肿瘤等。随着蛇毒毒理学、药物学、生物化学和分子生物学的发展，近年来国内外学者越来越重视蛇毒抗肿瘤作用的研究。据报道眼镜蛇毒在体内体外都具有抗肿瘤作用［1～3］。而眼镜蛇毒对NACC细胞株的作用如何，国内外尚未见报道。在本研究中，我们尝试应用近年发展起来的对恶性实体肿瘤有较高可评估率的新方法三磷酸腺苷-生物荧光肿瘤化疗药物敏感实验法（ATP-TCA法）［4］，研究眼镜蛇毒对人类小涎腺腺样囊性癌(NACC)细胞株的抑制作用，测定眼镜蛇毒与癌细胞存活的量效和时效关系，应用HE染色观察眼镜蛇毒作用NACC细胞后细胞形态学的改变，以及流式细胞术检测眼镜蛇毒作用后的NACC细胞凋亡等方面的实验，为眼镜蛇毒的抗肿瘤临床应用提供实验依据。
       1  材料与方法
       1.1  药品与仪器
       中华眼镜蛇毒冻干粉（广西医科大学蛇毒研究所）；ATP试剂盒［德国DCS公司，包括：完全分析培养基（CAM）、ATP提取液、荧光素-荧光酶、稀释缓冲液、ATP标准品、96孔检测板、针管、过滤器、过滤膜等］;胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）;青霉素（哈药集团制药总厂）;链霉素(大连美罗大药厂)；RPMI1640培养基(美国Hyclone)。微孔板式自发光分析仪（德国BETHOLD公司）；水套式CO2培养箱（美国 FORMA 公司）；流式细胞仪（ 美国 BECKMAN COULTER公司 ）；倒置相差显微镜（德国ZELSS公司）；病理图象分析仪（德国LEICA公司）。
       1.2  细胞株
       人类小涎腺腺样囊性癌细胞株（广西医科大学口腔医院）。
       1.3  人类小涎腺腺样囊性癌细胞的培养
       将人类小涎腺腺样囊性癌细胞按常规方法培养于含10%胎牛血清，青霉素100 u/ml和链霉素100 μg/ml的RPMI1640培养基中，于37℃、5%CO2的培养箱中培养。取对数生长期人类小涎腺腺样囊性癌细胞用0.125%胰酶消化后收集细胞悬液，细胞计数板计算细胞数，加入完全分析培养基（CAM）制成1×105/ml细胞悬液。
       1.4  ATP-TCA法测定人类小涎腺腺样囊性癌细胞增殖的抑制率 将眼镜蛇毒冻干粉，用完全分析培养基（CAM）溶解，倍比稀释成100，50，25，12.5，6.25 μg/ml的不同浓度蛇毒溶液，每种蛇毒浓度各取100 μl分别置96孔板中，每个蛇毒浓度组设4个复孔作为实验组，并设未加蛇毒孔作为对照组。于各孔中加入1×105/ml的细胞悬液100 μl，置5%CO2，37℃饱和湿度培养箱中分别培养24，48，72，96 h，然后向各孔中加入ATP提取液50 μl，多次吸取混匀，避免产生气泡，室温下孵育5 min。从各孔中吸取50 μl培养液，置96孔检测板中，在每个检测孔中加入50 μl荧光素-荧光素酶测试试剂，充分混匀，在微孔板式自发光分析仪上进行ATP荧光测定。根据含药孔的荧光值与无药孔的荧光值的比较，得出该浓度药物对肿瘤细胞的抑制值，作出蛇毒剂量-抑制曲线。
        
       依据下式计算肿瘤细胞生长抑制（TGI）百分率：
        
       抑制率（%）=1-F试验组F对照组×100%
       1.5  NACC细胞周期及凋亡率的测定
       对数生长期细胞用0，5，10，20 μg/ml蛇毒分别作用24 h，用胰酶消化后，收集2×106个细胞，预冷PBS洗涤1次，加入70％乙醇4℃固定过夜。离心弃乙醇，PBS洗涤1次后加入RNA酶(1 mg／ml)240 μl。37℃水浴30 min后，加入PI综合染液(PI浓度为124 μg/ml，Triton X-100浓度为0.124％)1 ml，4℃避光染色30 min，用流式细胞仪检测凋亡细胞，结果采集用SYSTEM Ⅱ软件，细胞周期分析采用MultiCycle软件。
       1.6  细胞形态学的观察
       将NACC接种于25 ml培养瓶中，设蛇毒（25 μg/ml）实验组和对照组，在相差显微镜下动态观察药物对癌细胞的影响。同时在培养皿中放置无菌盖玻片培养制备细胞爬片光镜标本，HE染色观察。
       1.7  统计学处理
       实验数据以±s表示，以SPSS10.0统计软件进行方差检验。
       2  结果
       2.1  蛇毒对人类小涎腺腺样囊性癌细胞的抑制作用 不同浓度的蛇毒对体外生长的NACC细胞有明显的抑制作用，且随着蛇毒浓度升高而增强。以药物浓度-抑制率作图。见图1。表1  不同浓度蛇毒在不同时间对NACC细胞增殖的影响(略)
        
       用ATP-TCA法测定不同浓度的蛇毒在不同时间内对NACC细胞影响。结果表明，作用24，48，72，96 h后，所有受试浓度的蛇毒对NACC癌细胞生长均有抑制作用，与对照组比较，均有统计学意义(P＜ 0.05或P＜0.01)。见表1。
       2.2  眼镜蛇毒对NACC细胞凋亡和细胞周期的影响 不同浓度的眼镜蛇毒作用肿瘤细胞24 h后，与对照组相比，对凋亡率及细胞周期有明显影响，出现凋亡现象；对照组中只有极少量的凋亡细胞存在；而随着眼镜蛇毒浓度的增高，其肿瘤细胞的凋亡率也逐渐增加。同时观察到在给予眼镜蛇毒后，可使G0/G1期细胞增多，出现G0/G1期阻滞，S期和G2/M期细胞数减少，提示眼镜蛇毒通过抑制NACC细胞分裂增殖，而且在G0/G1期被阻滞的肿瘤细胞数随着眼镜蛇毒浓度增加而增多。见表2。表2  眼镜蛇毒作用NACC细胞24 h细胞周期和凋亡率的变化组别细胞周期分布（略）
       2.3  形态学观察分析
       用倒置相差显微镜观察消化后接种的NACC细胞在2～3 h内均匀贴壁，6 h开始出现分裂增殖，细胞生长良好，胞浆均匀，核分裂象多见。加入25 μg/ml蛇毒作用24 h后，NACC细胞贴壁明显减少，细胞收缩，变小，有的细胞破碎，脱落漂浮于培养液。NACC细胞经HE染色后，对照组细胞结构清晰，细胞镶嵌排列形态较规则。实验组细胞结构不清晰，细胞镶嵌排列形态不规则，显微镜观察可见明显的细胞质空泡、核固缩、核染色质聚集等形态学变化。
       3  讨论  
           
       ATP是细胞内能量的基本来源, 其水平与活细胞数呈线性关系。采用荧光素-荧光酶系统，在有氧条件下与ATP反应而产生荧光，通过测定发出的荧光强度来反映细胞中ATP的含量，进而反映出活细胞的数量。在体外测定经不同浓度药物直接杀伤培养肿瘤细胞中的ATP含量，即可判断该肿瘤细胞对药物的敏感程度［5］。
        
       近年来，国内外对蛇毒抗肿瘤作用的研究日趋重视。各类蛇毒中，中华眼镜蛇蛇毒的直接抗癌效应最强。许多实验都证实了眼镜蛇粗毒对体外培养的胃癌细胞、白血病细胞等有明显的杀伤作用，对人肝癌、鼻咽癌的裸鼠实体瘤均有明显的抑制作用［6］。在本研究中，我们应用ATP-TCA法进行实验，发现中华眼镜蛇毒通过直接用药后，对NACC细胞的生长、增殖阶段均具有抑制作用，并随着剂量的逐步增加，其抑制率逐步增强。从表1中可见，当中华眼镜蛇毒的剂量不变时，经过24，48，72，96 h 4个时段，药物抑制NACC细胞作用随着时间的延长其抑制率逐步增强。ATP-TCA法同现今较常用的MTT法［3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyl  Tetrazoliumbromide］相比，有以下优势：①药物浓度呈线性范围更大，有5～6个级数，判断趋势更明显；②成功率及可重复性高；③干扰因素少。MTT法中细胞的代谢率、pH值、温度和某些药物都可能影响MTT转化。ATP-TCA法中的CAM培养基能抑制纤维细胞、血细胞的生长，减少干扰［7］。因此，我们认为ATP-TCA法用于体外抗肿瘤药物筛选在方法学上是科学可靠的，值得选择。
        
       细胞凋亡是一种主动的、非炎症性的、能量依赖性的细胞死亡形式，许多肿瘤药物是通过诱导细胞凋亡而发挥作用的［8，9］。本实验结果表明，通过倒置相差显微镜观察，中华眼镜蛇毒作用后的NACC细胞贴壁明显减少，细胞收缩，变小、变圆，有的细胞破碎，漂浮。HE染色可见明显的细胞质空泡、核固缩、核染色质聚集等形态学改变。经流式细胞仪检测分析，中华眼镜蛇毒能诱导NACC细胞凋亡，并且随着作用时间的延长和给药剂量的增大，NACC细胞凋亡率增高，蛇毒浓度在20 μg/ml时NACC细胞凋亡率为57.4%。肿瘤细胞的最基本特征是细胞的失控性生长，而失控性增生的根本原因就是细胞周期调控机制的破坏。因此，影响细胞周期进程和细胞增殖，有可能启动细胞凋亡程序，产生抗肿瘤作用。本研究结果表明，中华眼镜蛇毒处理后的NACC细胞，随着蛇毒质量浓度的增加，G0/G1期细胞百分比增高，S期细胞百分比降低，凋亡的细胞增多，而未经蛇毒处理的NACC细胞增殖正常，提示中华眼镜蛇毒通过抑制NACC细胞分裂增殖，将细胞周期阻滞于G0/G1期，从而降低肿瘤细胞的增殖能力，产生抗肿瘤作用。由于眼镜蛇毒中成分复杂，其活性成分均为各种蛋白质或多肽类物质，其中有多种对机体有剧毒的毒素如神经毒素、细胞毒素及心脏毒等。本研究证实了中华眼镜蛇毒对NACC细胞具有体外抗癌活性，为今后从中华眼镜蛇毒中纯化有效的抗肿瘤组分提供了科学理论依据。
       【参考文献】
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