文章标题 全文   多个检索词，请用空格间隔。

       【摘要】 
       目的研究从夏枯草提取液中分离纯化齐墩果酸和熊果酸的工艺。方法夏枯草乙醇提取液经溶剂萃取和酸碱沉淀后，再用大孔吸附树脂进一步富集纯化两种五环三萜酸。结果X-5型大孔树脂富集纯化齐墩果酸和熊果酸的最优条件为：采用两者总浓度为1.324 g/L的夏枯草样品液上柱，调节pH=7左右，室温下以流速1.0 BV/h吸附饱和；解吸时先用水淋洗，再用30%，50%，70%，90%(V/V)(pH=11)乙醇解吸，流速1.0 BV/h，收集90%乙醇洗脱液，所得产品中两者总含量达到87.30%，收率为81.30%。 结论该工艺简单可行，产品中目标组分纯度和收率较高，易实现工业化。
       【关键词】  大孔树脂 夏枯草 齐墩果酸 熊果酸 分离纯化
        夏枯草Prunella vulgaris L.是唇形科植物夏枯草的干燥果穗，具有降压、抗炎、抑制免疫、抗菌和降血糖等作用［1］，其中两种主要五环三萜类成分齐墩果酸和熊果酸已被证实具有抗癌、消炎和抗病毒等作用［2，3］。硅胶柱层析是最常用的分离纯化三萜类成分的技术，但其工艺流程较长，硅胶不易于再生，工业化成本高。近年来，大孔吸附树脂技术以其独特的优势广泛用于中草药中水溶性物质的分离，如水溶性生物碱、黄酮类、苷类、皂苷类、多酚类或酸性化合物、糖类、维生素、色素等［4，5］。大孔吸附树脂分离脂溶性成分，特别是三萜皂苷元的研究很少［6，7］。本文尝试筛选大孔吸附树脂对夏枯草中两种五环三萜酸进行富集纯化，以期对中药夏枯草产品的开发和拓展齐墩果酸及熊果酸的药源贡献一点微薄之力。
       1  器材与方法
       1.1  仪器和试剂
       夏枯草为市售药材，经鉴定为Prunella vulgaris L.的干燥果穗；齐墩果酸(Oleanolic acid,OA)和熊果酸(Ursolic acid,UA)对照品(HPLC纯度≥98%)购自中国药品生物制品检定所；D4020，S-8，X-5，AB-8，NKA-9，D3520，D4006，NKA-II型大孔吸附树脂购自南开大学化工厂；其它试剂均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水。
        PHS-3C型精密酸度计（上海雷磁仪器厂）；岛津LC-2010A高效液相色谱仪，配有二极管阵列检测器VP SPD-M10A，Hedera ODS-2色谱柱(4.6 mm×250 mm，5  μm)。
       1.2  大孔吸附树脂的预处理树脂先用无水乙醇浸泡24 h，待充分溶胀后用无水乙醇在提取器内提取8h，以除去树脂中所含杂质。湿法装柱至柱高2/3处，依次用下列溶液冲洗：95%(V/V)乙醇以流速2BV/h洗至流出液澄清；水以2 BV/h的流速洗尽乙醇，φ(HCl)=5%的水溶液以流速4～6 BV/h进行淋洗，并浸泡2～4 h，水洗至中性；w (NaOH)=2%的水溶液以流速4～6 BV/h进行碱洗，水洗至中性，即处理完毕。
       1.3  样品制备及测定方法
       1.3.1  夏枯草样品制备 
       将夏枯草在烘箱中60℃下干燥24 h，粉碎过40目筛。称量大约2.0 kg粉末，加入10 L 95%(V/V)乙醇80℃下回流两次，2 h/次，得深绿色浸膏。加适量水制成悬浮液后经石油醚、氯仿、正丁醇萃取。将氯仿萃取部分浓缩蒸干，无水乙醇溶解后，用5%NaOH调节溶液pH=11，所得滤液用10%HCl酸化至pH=3，再加入1倍量pH=3的蒸馏水，过滤所得沉淀用蒸馏水洗至中性，60℃真空干燥，得到包含OA和UA在内的三萜酸富集物，用pH=7的75%(V/V)乙醇溶液配制成两者总量为2.137 g/L的夏枯草样品液。
       1.3.2 夏枯草样品中三萜酸含量测定 
       采用反相高效液相色谱法测定OA和UA的含量，以保留时间定性，外标法定量。色谱条件如下：流动相为甲醇-水-冰醋酸（90∶10∶0.3，V/V/V)；流速1.0 ml/min；检测波长λ=210 nm；进样量10 μl；柱温30℃。实验发现OA和UA进样量分别在0.36～3.6 μg和0.78～7.8 μg时，进样量(m/μg)和峰面积(s/μV·s)呈良好的线性关系。熊果酸的回归方程式为s=187 023+3.066 36×106 m,r=0.999 91；齐墩果酸的回归方程式为s=7 341.52+2.563 81×106 m，r=0.999 95。
       1.4  大孔吸附树脂筛选选择D4020，S-8，X-5，AB-8等8种大孔吸附树脂进行实验，测定这8种树脂对夏枯草中两种五环三萜酸的静态吸附量和解吸率以筛选树脂。取1.0 g预处理好的大孔吸附树脂于带塞的磨口锥形瓶中，加入OA和UA总浓度为2.137 g/L的夏枯草样品液40.00 ml，于室温下振荡（180 r/min）24 h至吸附平衡，测定滤液中两者含量，按式(1)计算各树脂的静态吸附量。用pH=11的90%(V/V)乙醇溶液40.00 ml对吸附饱和的树脂进行解吸，测定解吸液中两者的含量，按式(2)式计算解吸率。
       
       吸附量（mg/g）-（Co-Ce）×Vm式(1)
       
       解吸率（%）=V1c1(co-ce)V×100%式(2)
       
       其中co起始浓度，ce平衡浓度，V吸附液体积，m树脂质量，c1为解吸液浓度，V1为解吸液体积。
       1.5  静态吸附实验准确称取已预处理的树脂1.0 g于具塞的磨口锥形瓶中，加入OA和UA总浓度为2.137 g/L的夏枯草样品液40.00 ml，室温下振荡（180 r/min）24 h至吸附平衡。定时取样进行分析，计算吸附量，绘制静态吸附动力学曲线。
       
       准确称取已预处理的树脂1.0 g于具塞的磨口锥形瓶中，加入不同浓度的夏枯草样品液40.00 ml，室温下振荡（180 r/min）24 h至吸附平衡，测定吸附平衡时夏枯草提取液中OA和UA的浓度，计算吸附量，绘制静态吸附等温线，并用Langmuir等温吸附方程式对实验结果进行拟合。
       1.6  动态吸附容量的测定将夏枯草样品液通过已预处理的装有1.0 g树脂的层析柱，进行动态吸附，分段收集流出液，测定收集液中OA和UA的含量，考察泄露曲线，确定样品液的最大上柱体积。
       1.7  动态吸附和动态解吸实验将10 g已预处理的树脂湿法装入2 cm×50 cm层析柱中，将夏枯草样品液以一定的流速通过色谱柱，测定流出液中OA和UA的含量，考察上柱液pH值、浓度、流速等因素对树脂吸附性能的影响，确定最佳的吸附工艺条件。对已吸附样品的树脂用乙醇溶液进行动态解吸实验，考察洗脱剂pH值、流速等对树脂解吸性能的影响，测定不同条件下解吸液中OA和UA的浓度，确定最佳的解吸工艺条件。
       2  结果
       2.1  树脂筛选结果在相同的实验条件下，测得各树脂的静态吸附解吸结果如表1所示，X-5型大孔树脂对夏枯草中两种三萜酸具有较高的吸附量和解吸率。实验结果表明，吸附量较大的多为非极性或弱极性树脂，如X-5、D4020、AB-8型等。原因可能是夏枯草中三萜类成分为皂苷元，属于弱极性物质，与这类大孔树脂具有特异性吸附。而X-5型大孔树脂较其它几种非极性树脂吸附、解吸能力更好，这可能跟其较大的比表面积和孔径有关。表1  大孔吸附树脂的结构性能参数及静态吸附解吸结果
       （略）
       2.2  静态吸附动力学过程在充分时间内用X-5型大孔树脂吸附夏枯草样品液至饱和，吸附时定时取样测定OA和UA的浓度，绘制静态吸附动力学曲线（见如图1）。结果表明8 h后树脂吸附平衡。
       2.3  静态吸附等温线在室温下，配制不同浓度的夏枯草样品液，用X-5型大孔树脂吸附饱和，测定吸附平衡时OA和UA的浓度，计算饱和吸附量，绘制静态吸附等温线见图2。
       采用Origin软件的线性拟合工具，利用Langmuir等温吸附方程的线性形式对实验结果进行拟合，如图3所示。Langmuir等温吸附方程式是建立在试验基础上的吸附理论，其方程式如下：qe=qmKαCe/(1+KαCe)。其中Kα是Langmuir等温吸附方程式常数，qm是吸附剂饱和吸附量，qe为平衡时的吸附量，Ce为平衡时的溶液浓度。以浓度Ce为自变量，Ce/qe 为因变量，化Langmuir方程为线形方程Ce/qe=1/qmKα+Ce/qm。代入实验数据得方程Ce/qe= 0.014 85+0.025 04 Ce，相关系数R2=0.998 70，拟合结果比较理想。
       2.4   动态吸附容量的测定将OA和UA总浓度为1.324 g/L的夏枯草样品液通过装有1.0 gX-5大孔树脂的层析柱。每2 ml取1次吸附液，测定其中两者的含量，绘制泄露曲线如图4所示。我们发现上柱液体积为26 ml时达到吸附饱和，这时树脂的吸附量为21.93 mg/g。
       2.5 上柱液的pH值对树脂吸附量的影响取5份X-5树脂10 g，湿法装入2 cm×50 cm色谱柱中，将OA和UA浓度为1.324 g/L的样品液260   ml调成不同pH值(3，5，7，9，11)的溶液，在相同条件下进行动态吸附。结果表明，pH=7时打孔树脂的吸附量最大。上柱液的pH过小，蒸馏水第一步洗脱时便有三萜酸沉淀析出，大孔树脂为非特异性吸附；上柱液的pH值过大，OA和UA形成盐，在上柱液中溶解性能增强，也不利于树脂吸附。
       2.6  上柱液的浓度考察准确移取相同物质量的OA和UA以不同浓度、相同流速通过装有10 g X-5大孔树脂的层析柱，测定流出液浓度（见表2）。当夏枯草样品液的浓度为1.324 g/L时，大孔树脂的吸附量最大，所以选择动态吸附的上样浓度为1.324 g/L。表2  上柱液浓度对动态吸附的影响（略）
       2.7  上柱液的流速对树脂吸附量的影响将260 ml，1.324 g/L的夏枯草上柱液调节pH=7，以不同流速(0.5 BV/h，1.0 BV/h，1.5 BV/h，2.0 BV/h，2.5 BV/h)通过装有10 g X-5大孔树脂的层析柱，考察不同流速对树脂吸附量的影响（见图5）。X-5大孔树脂对OA和UA的最佳吸附流速为1.0 BV/h。流速过大，树脂吸附率下降；流速过小则达到吸附平衡时间延长。
       2.8  洗脱剂的选择根据环保工艺的要求，采用乙醇水溶液为洗脱剂。由于X-5型树脂为非极性大孔树脂，故极性小的溶液洗脱能力强。因此洗脱时，先用极性较强的蒸馏水将非特异性吸附物质（主要为多糖和一些杂质）洗脱，然后由低到高用不同浓度乙醇溶液强其它成分洗脱，最后采用高浓度乙醇将目标组分洗下。本实验以蒸馏水、30%，50%，70%，90%(V/V)乙醇溶液作为层析柱洗脱剂。
       2.9  洗脱剂pH值对大孔树脂解吸附的影响将夏枯草样品液调节pH=7上柱，静置480 min后，依次用蒸馏水、30%，50%，70%(V/V)乙醇洗脱，再用pH=11的90%乙醇洗脱，测定洗脱液中OA和UA的含量。按同样方法调节pH分别为7～13的90%乙醇洗脱，测定两者的含量（如图6）。洗脱剂的pH值越大，洗脱剂的洗脱能力越强。当pH=11时，洗脱率可以达到81.30%。原因可能是在解吸过程中，吸附的OA和UA与碱性洗脱剂发生反应生成钠盐，导致大孔树脂对两者的吸附能力下降，钠盐较易进入洗脱液中。pH值继续升高，洗脱率基本保持不变。因此，洗脱剂的pH值选择在11左右。
       2.10   动态解吸洗脱液流速的影响对吸附饱和的树脂用pH=11，2.0 BV的90%(V/V)乙醇以不同流速进行洗脱，实验结果表明，流速越慢树脂解吸效果越好，但太慢又会使工作周期延长，因此实验选择流速1.0 BV/h。
       2.11  动态吸附洗脱验证综合上述实验结果，确定了X-5型大孔吸附树脂富集纯化夏枯草中两种三萜酸的最佳工艺条件：采用1.324 g/L夏枯草样品液上柱，调节pH=7左右，室温下以流速1.0 BV/h吸附饱和；解吸时先用蒸馏水、30%，50%，70%(V/V)乙醇淋洗，最后用2.0 BV，pH=11的90%(V/V)乙醇解吸，流速1 BV/h。收集液调节pH=3后再加1倍量pH=3的蒸馏水后过滤，烘干滤渣，重结晶，按“1.3.2”项色谱条件测定其中OA和UA总含量，样品中两者总含量可达87.30%，收率为81.30%。HPLC测定混合OA，UA标准品及大孔树脂洗脱前后的色谱图见图7(a～c)。
       3  结论
       X-5型大孔吸附树脂能够有效地富集纯化夏枯草中两种五环三萜酸成分，产品中目标组分的纯度和收率较高，结果证明该工艺流程简单易行。
       最终产品中两种三萜酸OA和UA共存，需经制备色谱进一步分离得到单体。
       【参考文献】
         　　［1］肖培根. 新编中药志［M］.北京：化学工业出版社，2001：763.
       
       ［2］肖坤福，郑云法，刘成左，等. 熊果酸的研究进展［J］. 时珍国医国药，2005,16(12)：1298.
       
       ［3］王德仁. 齐墩果酸研究新进展［J］.天津药学，2003,15(3)：56.
       
       ［4］闫磊，何再安，刘焱文. 大孔吸附树脂在中药研究中的应用［J］.时珍国医国药，2006,17(12)：2585.
       
       ［5］梁少玲，蔡宇，杨燕霞，等. 大孔树脂吸附在黄酮及皂苷类成分分离纯化中的应用［J］.时珍国医国药，2006,17(2)：277.
       
       ［6］任秀莲，周春山，魏琦峰，等. 苦丁茶中熊果酸的分离纯化研究［J］.中国药学杂志，2004,39(8):571.
       
       ［7］廖晓峰，陈正行，姚惠源，等. 大孔树脂吸附分离栀子浸提液中的三萜酸及结构鉴定［J］.食品科学，2006,27(8):114.