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       【摘要】 
       目的探讨茶黄素对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后细胞凋亡及凋亡相关基因的影响。方法采用线拴法建立大鼠大脑中动脉栓塞(MCAO)模型。大鼠随机分为缺血组，假手术组，茶黄素小剂量组(10 mg/kg)，茶黄素大剂量组(20 mg/kg)。缺血2h，再灌注24 h后处死动物，于再灌注前舌下静脉给药。测定大鼠神经系统症状，脑梗塞体积，脑组织MDA，NO含量以及SOD和GSH-Px活性，采用TUNEL法检测脑组织细胞凋亡，采用免疫组织化学法检测凋亡相关基因Caspase-3的表达。结果茶黄素治疗组与模型组相比神经系统症状减轻，脑梗塞体积缩小，脑组织MDA，NO含量减少，SOD和GSH-Px活性增加。脑组织细胞凋亡及Caspase-3表达减少。结论茶黄素对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤具有保护作用，其作用机制可能与抗氧化和抑制细胞凋亡有关。
       【关键词】  茶黄素 缺血再灌注 细胞凋亡 Caspase-3
       The Protective Effect of Theaflavin on Focal Ischemia-reperfusion Injury in Rats
       CAI Fei, LI Cairong, WU Jiliang, MIN Qing, OUYANG Changhan, YU Wei
       Department of Pharmacology, Medical College, Xianning University, Xianning 437100, China
       Abstract：ObjectiveTo study the effect of theaflavin on cell apoptosis and apoptosis related gene after focal cerebral ischemia injury in a rat model of middle cerebral artery occlusion (MCAO). MethodsMale Sprague-Dawley rats were anesthetized and subjected to 2 h of MCAO followed by 24 h reperfusion.  The neurological deficits and the sizes of cerebral infarction were measured. The contents of malondialdehyde (MDA), and nitric oxide (NO) in brains were tested. The activities of superoxide dismutase (SOD) and glutathione peroxidase (GSH-Px) were also tested. TUNEL staining to label the neuronal apoptosis and immunohistochemistry to detect the expression of caspase-3 protein were used.ResultsThe neurological deficits and the sizes of cerebral infarction were decreased in theaflavin-treated groups. The contents of MDA and NO in theaflavin-treated groups were lower than those of the ischemic group. The activities of SOD and GSH-Px in theaflavin-treated groups were higher than that of the ischemic group. Theaflavin-treatment also decreased neuronal apoptosis and the expression of caspase-3 protein. ConclusionTheaflavin has protective effects on focal cerebral ischemic reperfusion injury through inhibiting oxidative stress and lessening apoptosis.
       Key words：Theaflavin;   Ischemia-reperfusion;   Apoptosis ;   Caspase-3
       
       据国内外流行病学调查表明，脑血管病是一类严重威胁人类健康和寿命的常见病，多发病，是目前世界上导致人类死亡的三大主要疾病之一。在我国，脑血管病已经上升为第一位致死致残疾病。脑缺血后能量代谢障碍、细胞内Ca2+超载及其所引发的谷氨酸的兴奋性毒性反应是神经元损伤的始动环节，由此产生一系列生化反应。在脑缺血损伤中，细胞凋亡是由各种凋亡刺激信号始动，受细胞内源性基因、酶类和信号传导途径等调控的“瀑布式”激活过程。自由基、细胞内钙超载等均是促进凋亡的诱导因素。这些因素都是通过一定的信号传导途径激活凋亡相关基因，然后将信号传递到核内切酶，而执行死亡的功能。其中蛋白酶与细胞凋亡密切相关，凋亡的发生是一个复杂的、由caspase家族成员介导的蛋白酶级联反应过程。进一步探讨并揭示脑缺血/再灌注时损伤的机制，有助于采取相应的干预措施阻断炎症的级联反应,减少神经元死亡，对临床更有效地防治缺血再灌注性脑损伤具有十分重要的理论和实际意义。茶黄素（theaflavin,TF1）是红茶中的多酚类化合物之一，具有很强的抗氧化、抗炎、清除自由基、抗肿瘤等作用［1～4］。我们首次观察到茶黄素对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤有保护作用，并发现其保护机制可能与抗氧化和抑制细胞凋亡有关。
       1  材料与方法
       1.1  试剂 
       茶黄素(MicroSource Discovery System, Inc. Gaylordsville, CT)，纯度98％。GSH-Px，MDA，SOD试剂盒（南京建成）。其余试剂均为国产分析纯。
       1.2 动物模型
       雄性Wistar大鼠，体重220～260 g，由湖北省医学科学院实验动物中心提供。大鼠大脑中动脉阻塞（MCAO）模型以Longa［4］法为标准，选用尼龙线栓塞右侧大脑中动脉。10%的水合氯醛0.35 ml·（100g）-1腹腔注射麻醉，颈部皮肤用碘伏消毒，作正中皮肤切口，分离肌肉，找出右颈总动脉（CCA）并游离，穿线备用。沿右侧颈总动脉向头端分离颈内、外动脉，颈外动脉（ECA）及其分支穿线结扎。沿颈内动脉（ICA）向颅内方向分离，至翼额动脉，分离翼额动脉并于其根部结扎。然后结扎颈总动脉。在颈总与颈内外动脉分叉处剪一小口，用0.2 mm的尼龙线插至颅内，深约（18±0.5） mm，直至大脑前动脉，阻断大脑中动脉，引起局灶性脑缺血。待动物清醒后，观察神经系统症状以判断手术是否成功。实验分4组：假手术组（Sham）、缺血－再灌注组（Ischemia）、茶黄素低剂量组(10 mg/kg)、茶黄素高剂量组(20 mg/kg)。持续缺血2 h，再灌注24 h后处死动物，于再灌注前舌下静脉给药。
       1.3   检测指标
       1.3.1  神经系统症状评分Longa五分制评分标准［5］：无神经损伤症状0分；不能完全伸展对侧前爪1分；向对侧转圈2分；向对侧倾倒3分；不能自发行走，意识昏迷4分。
       1.3.2  梗塞体积测定采用TTC（氯化-2,3,5-三苯基四氮唑）染色方法，将处死后的大鼠脑组织进行冠状切片，间隔1 mm，2％TTC染色30 min后用10％的甲醛溶液固定、摄像，以排水法测梗塞体积。
       1.3.3  生化指标检测MDA，NO含量，SOD，GSH-Px活性检测按试剂盒操作进行。
       1.3.4  脑组织细胞凋亡原位检测每一标本取两个不同部位的切片各2张，其中一张按末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）介导的带地高辛的dUTP缺口末端标记法（TdT-mediated digoxin-dUTP nick end labeling, TUNEL）标记凋亡细胞核DNA3"-OH末端。光镜下正常细胞核呈蓝色，凋亡细胞核为深浅不一的棕褐色。在光镜下200×放大，通过图象分析系统在每张切片上随机选取10个视野，测定阳性染色的平均光密度与阳性细胞百分比，计算心肌组织细胞凋亡指数（apoptotic index, AI）：AI=平均光密度×（凋亡阳性细胞数/总心肌组织细胞数）×100%。
       1.3.5  脑组织caspase-3蛋白表达检测采用过氧化物酶标记的链霉卵白素 (Streptavidin/Peroxidase, SP)染色的免疫组化检测caspase-3蛋白表达。着棕黄色为阳性细胞，胞浆、胞核着色。在光镜下200×放大，通过图象分析系统在每张切片上随机选取缺血区周围半暗区10个视野，测定阳性染色的平均光密度与阳性细胞百分比，计算大脑神经细胞阳性表达指数（positive expression index, PEI）：PEI=平均光密度×（阳性细胞数/总神经细胞数）×100%。
       2  结果
       2.1  茶黄素对脑缺血神经系统症状的影响
       缺血再灌注组表现出明显的神经缺陷症状，神经系统症状评分增加。茶黄素大剂量组和小剂量组均可明显改善神经缺陷症状,且大剂量组比小剂量组更明显。结果见表1。
       2.2   茶黄素对脑梗塞体积变化的影响 
       缺血再灌注组、治疗各组脑梗塞体积均高于假手术组，茶黄素大剂量组和小剂量组脑梗塞体积明显低于缺血再灌注组，与之相比有显著性差异(P＜0.01)。结果见表1。表1  茶黄素对脑缺血神经系统症状和脑梗塞体积变化的影响（略）
       
       2.3  茶黄素对脑组织MDA和NO含量的影响
       缺血再灌注组、治疗组MDA和NO含量增加，显著高于假手术组，茶黄素大剂量组和小剂量组能明显降低脑组织MDA和NO的含量，与缺血再灌注组相比有明显差异(P＜0.01)。结果见表2。
       2.4  茶黄素对脑组织SOD 和GSH-Px活性的影响
       缺血再灌注组、治疗组SOD和GSH-Px活性较假手术组明显降低，茶黄素大剂量组和小剂量组能显著增加脑组织SOD和GSH-Px活性，其活性明显高于缺血再灌注组(P＜0.05，P＜0.01)。结果见表2。表2  茶黄素对脑组织MDA和NO含量以及SOD和GSH-Px活性的影响（略）
       2.5  茶黄素对脑组织细胞凋亡的影响
       光镜下正常细胞核呈蓝色，凋亡细胞核为深浅不一的棕褐色。结果显示，TUNEL法染色阳性的凋亡细胞主要位于梗死灶与正常脑组织交界的周边区，假手术组未见凋亡细胞，缺血再灌注组凋亡细胞明显增多，AI值显著高于假手术组（P<0.01）；茶黄素治疗组凋亡细胞明显减少，AI值显著低于缺血再灌注组（P<0.01），结果见表3。
       2.6  茶黄素对脑组织Caspase-3蛋白表达的影响Caspase-3蛋白表达细胞为胞浆、胞核着棕黄色，Caspase-3基因蛋白表达的部位与凋亡细胞的部位相似。在假手术组中Caspase-3的PEI很低；缺血再灌注组 Caspase-3蛋白表达显著高于假手术组（P<0.01）；茶黄素大、小剂量组和缺血组相比，Caspase-3的PEI明显下降（P<0.01,P <0.05,P<0.01）。结果见表3。表3  茶黄素对大鼠脑组织细胞凋亡和Caspase-3蛋白表达的影响（略）
        
       3   讨论
          
       脑缺血后，神经元存活的数量是决定预后的重要因素。脑缺血后神经元死亡是一个极其复杂的病理过程。生理情况下，体内自由基的生成与清除处于一种动态平衡中，但在某些病理状态下，特别是组织缺血，可通过多种途径使自由基生成增多。自由基可与细胞成分如细胞膜磷脂、蛋白质、核酸等发生反应，最终使细胞膜的完整性遭到破坏。脑是富含磷脂的器官，其不饱和脂肪酸含量最高，故最易受自由基攻击，从而引发链式脂质过氧化反应，形成了大量脂质过氧化物（MDA）损伤细胞膜，进而使细胞死亡。
       
       研究表明［1，2］，即缺血级联反应，这是决定缺血后神经元命运的主要因素。缺血后神经元死亡主要表现为坏死和凋亡两种形式，分别涉及主动和被动细胞死亡机制［3，4］。在脑缺血急性期，神经元坏死与凋亡并存，细胞坏死位于缺血中心区，细胞凋亡主要出现在缺血半暗带。而在脑缺血的迟发性神经元死亡期，则以细胞凋亡为主。凋亡可能决定了最终梗塞体积［5，6］。细胞凋亡是在生理和病理条件下的一种主动死亡方式，是受细胞内基因和一些细胞外因子调控的生物学过程。近来研究结果证明脑缺血后神经细胞死亡是由Caspase介导［7］，Caspase-3参与了脑缺血后神经元损伤的病理过程，在缺血性神经元死亡中起重要作用［8］。
       
       Caspase-3是凋亡过程中最重要的蛋白酶，是多种死亡受体介导凋亡途径的共同下游效应部分，是细胞凋亡蛋白酶级联反应的必经之路［8］。正常情况下，胞质中Caspase-3以无活性的酶原形式存在。脑缺血后，各种损伤因素作用下，激活Caspase-3，导致神经元凋亡。虽然目前还没有完全弄清Caspase诱使细胞凋亡溃解的机理，但已有的研究可以肯定它至少从3个方面参与这一过程：①分解凋亡保护蛋白，如ICAD/DFF45、凋亡抑制性bcl-2家族成员；②直接解聚细胞结构，caspase能分解核层的中间丝而致使坚固的核层结构解体，导致核膜破坏和染色体凝缩；③使细胞内一些参与DNA修复(如DNA -PKCS)、mRNA剪切(如U1-70K)和DNA复制 (如复制因子C)的酶(蛋白)失活或下调，从而使细胞丧失修复功能，稳态不能正常维持［9］。
       
       本实验检测到局灶性脑缺血再灌注24 h后大鼠脑皮质中有大量的凋亡细胞和Caspase-3蛋白表达，茶黄素对其有明显的抑制作用。结合文献及脑的病理生理，其机制可能与以下因素有关：①抑制脑组织自由基的产生，增加抗氧化酶活性，减少脑组织脂质过氧化损伤，保护生物膜的完整性；②茶黄素对DNA的损伤有修复作用，减少由于DNA损伤激活凋亡信号传递系统，使处于信号传导通路上的Caspase-3蛋白合成减少，抑制凋亡；③茶黄素抑制减少NO合成，从而减少EAA的毒性作用，阻止TNF活化从而抑制Caspase活化因子（如死亡受体）的活化，抑制Caspase-3蛋白的合成。
       【参考文献】
         　　［1］Lambert JD, Yang CS. Mechanisms of cancer prevention by tea constituents［J］.J. Nutr. 2003，133 (10):3262.
       
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