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       【摘要】 
       目的研究红豆杉枝叶中紫杉醇的含量测定方法，并对人工种植的云南红豆杉中紫杉醇的含量进行调查研究。方法采用甲醇和二氯甲烷超声提取样品，HPLC梯度洗脱。结果紫杉醇的理论塔板数为5628，分离度为1.42，拖尾因子为1.01。回归方程为Y=4×107X+39 942，r=0.999 7，在0.004 2～0.020 1/ml之间的线性关系良好。日内和日间精密度的RSD均小于2.0%，重复性实验的RSD为0.3%（n=5)，最低检测限为1.0μg/ml，加样回收率为85.19%，84.95%，82.37%，RSD（n=5)分别为3.7%，4.87%，3.6%。人工种植的云南红豆杉中紫杉醇的平均含量达140mg/kg。结论该方法缩减了红豆杉药材的前处理步骤，节约了实验时间，适用于红豆杉枝叶中紫杉醇含量测定；同时也证明中国思茅地区人工种植的红豆杉具备提取紫杉醇的价值，有较高的开发利用价值。
       【关键词】  红豆杉 紫杉醇 高效液相色谱法
       Determination of Taxol in Taxus by HPLC
       ZHOU Xiuling， PENG Quancai
       College of Chemistry and Bioengineering, Yichun University， Yichun， Jiangxi 336000，China
       Abstract：ObjectiveTo develop a method for measurement of paclitaxel in the taxus from Yunnan Province. MethodsThe medicinal plants was extracted with ethanol and dichloromethane. ResultsThe theoretical plate number of paclitaxel was 5628, the resolution was 1. 42 and the tailing factor was 1. 01. The calibration curve was linear in the range of 0.004 2～0.020 1 mg/ml, Y= 4×107 X+39 942, R=0.9997. The intra-day and inter-day precision (RSD) were all less than 2.0%, the recurrence (RSD) was 0.3% (n= 5). The limit of detection was 1.0 μ g/ml，the recovery rate was 85.19%，84.95%，82.37% and RSD was 3.7%，4.87%，3.6% (n=5) respectively for paclitaxel. ConclusionOur developed method can shorten the time used for pretreatment, and is a simple and reliable method to determine the content of paclitaxel in taxus. The results also prove that the quality of yew in Yunnan Province is relatively good.
       Key words：Taxus;    Paclitaxel;    High-performance liquid chromatography
       
       红豆杉属(Taxus spp)植物起源古老，属第三纪孓遗植物，在地球上已生存繁衍250万年，且地理分布区域广泛［1］。红豆杉属植物有9 种，主要分布在北半球的寒温带、温带和亚热带地区，全球目前发现的主要种类有：短叶红豆杉、加拿大红豆杉、球果红豆杉、杂种紫杉、欧洲红豆杉、佛罗里达红豆杉、东北红豆杉、云南红豆杉、中国红豆杉、南方红豆杉、西藏红豆杉等11个种，主要分布于北半球的寒温带、温带、亚热带。我国有４种１变种，即东北红豆杉、云南红豆杉、南方红豆杉（美丽红豆杉）、中国红豆杉(红豆杉)、西藏红豆杉(喜马拉雅红豆杉)［2］。紫杉醇(paclitaxel)是从红豆杉属植物中分离得到的一种具有独特抗癌作用的二萜类化合物。分子式为C47H51NO14，分子量为853，外观为白色针状结晶，熔点为213～216 ℃，比旋度［α］D20为-49. 1971年美国Wani等［3］从短叶红豆杉(Taxusbrevifolia)树皮中分离得到并确定了其化学结构，我们运用ChemDraw软件构建了其分子结构（见图1），同时使用Chem3D 软件模拟了其3D构象（见图2），这样就有便于我们直观的了解其最低能量 (energy minimum) 时的分子构象。紫杉醇是最具抗癌活性的天然化合物［4～6］，为一种广谱、高效、毒副作用小的抗癌药物, 在临床上运用于治疗卵巢癌、子宫颈癌、乳腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胃癌、喉癌、肝癌、食道癌、膀胱癌等恶性肿瘤［7］，主要机理是其与微管蛋白结合, 并促进其聚合，抑制癌细胞有丝分裂,阻止癌细胞的增殖［8］,目前紫杉醇已在美国、英国等四十余国上市［9］。到1996年紫杉醇的年需求量已达200 kg，销售额超10亿美元，2000年达到19亿美元。美国国立癌症研究所（NCI）预测，在今后10～15年紫杉醇将成为主要的抗癌药物。我国是癌症高发区之一，每年新增癌症发病人数200 万人，死亡130 多万人，目前全国肿瘤患者总数约为450 万人左右，国内的紫杉醇需求量，保守估计每年应该在1000 kg以上［10］。紫杉醇资源珍贵，价格高昂，制备的收率是紫杉醇成本最为关键的因素，其提取物中，紫杉醇的含量极低(0.03%～0.05%)，且含有大量的植物腊、色素和树胶等杂质，特别是其中共存许多分子结构和理化性质与紫杉醇极其相近的紫杉烷系列化合物［11］。紫杉醇在不同树种和树木的不同部位含量有所不同，其质量分数范围在3×10- 6～7×10-4之间。由于采样地点、测定方法和样品部位不同,所得结果也有一些差异［12～15］，且目前仍无普遍公认的检测方法。本文试图建立高效液相色谱法测定红豆杉枝叶中紫杉醇的含量的分析方法，并对云南红豆杉的枝叶中的紫杉醇含量进行了随机抽样调查，通过此来估计其枝叶中紫杉醇的分布情况，为合理开发我国红豆杉资源提供依据。
       1  材料与试剂
       1.1  药品与试剂
       甲醇(色谱纯)；二氯甲烷(分析纯)；超纯水；三氯甲烷(分析纯)；无水硫酸钠（优级纯）；紫杉醇对照品（含量大于99%）购自北京百灵威公司；云南人工种植红豆杉枝叶样品产于云南省思茅地区；高效液相色谱流动相组成为色谱纯甲醇及超纯净水。
       1.2  仪器
       岛津高效液相色谱仪，HPLC-20AT；20 μl进样阀；检测器；岛津色谱工作站；药材粉碎机；瑞士BUCHI旋转蒸发仪；Simplicity 185 personal超纯水器(美国Milli2 pore公司)；色谱条件:迪马C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；美国ELMA T660/H超声波清洗器(功率360 W，频率35 kHz)。
       2  方法与结果
       2.1  色谱条件流动相：A相甲醇，B相为水，梯度洗脱。B相随时间变化：40%（0～15 min），30%～0%（15～17 min），0%（17～21 min），40%（21～40 min），40 min（stop）；流速1.0 ml/min；柱温40℃，进样20 μl；检测波长227 nm；以色谱峰面积定量。在此条件下，测得紫杉醇的保留时间在20.5 min左右，样品溶液中主峰和其它杂峰达到完全分离。对照品、样品的色谱图见图3。
       2.2  对照品溶液的配制准确称取紫杉醇对照品10 mg,置于100 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，该贮备液浓度为100 μg/ml，准确吸取0.1 ml标准贮备液, 分别置于10，25，50，75，100 ml的量瓶中，用甲醇稀释至刻度，制成浓度为1.0，0.5，0.2，0.15，0.1 μg/ml的标准工作液。
       2.3  线性关系考察及重复性实验 
       在“2.1”色谱条件下将浓度为标准工作液依次从低浓度到高浓度进样，以对照品溶液浓度为横坐标(X),峰面积为纵坐标(Y)绘制标准曲线，并计算标准曲线的回归方程及相关系数。实验测得紫杉醇标准溶液浓度在0.004 2～0.020 1 mg/ml范围内，其线性回归方程为Y= 4×107 X+39 942，相关系数r=0.999 7, 结果表明线性良好。取同一供试样品6份,按供试品溶液的制备项下操作，在上述色谱条件下进样测定，RSD为0.3%, 表明本方法重复性好。
       2.4  检测限考察及方法精密度实验以产生信号(峰高) 为基线噪音标准差3倍的样品浓度作为该方法的检测限，即0.05μg/kg。取同一对照品溶液 20 μl，在上述色谱条件下重复进5次，计算RSD为 1.09%，取“2.2”项下供试品溶液，分别在2，4，8，16，24 h 进样，RSD为1.66%, 结果表明，供试品溶液在24 h内稳定性良好。
       2.5  回收率实验为考察方法的准确度，以现场样品加入高、中、低3 种含量的标准液,然后测定样品溶液和标准溶液计算加样回收率,设计2.0，0.4，0.2 mg 3个添加浓度，按“2.3”项操作，每个浓度作为5平行。结果见表1。表1  回收率实验结果（略）
       2.6  样品测定
       2.6.1  样品处理将阴凉通风处干燥样品，置粉碎机中粉碎(过40目筛)，精密称定样品约0.5 g，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20 ml，过夜，超声处理15 min，重复3次，合并甲醇溶液滤过蒸干，残渣水20 ml二氯甲烷20 ml，重复二次操作，合并二氯甲烷层，室温下减压蒸干，过氧化铝柱层析，用9∶1比例的甲醇和三氯甲烷进行洗脱，滤液蒸干，残渣加入甲醇10 ml定容，摇匀,0.20 μm滤膜过滤，取续滤液，上机备用。
       2.6.2  测定取试样溶液20 μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，获取峰面积，从标准曲线上查得样品中紫杉醇的浓度。用上述试验方法对70个人工种植的云南红豆杉的枝叶中的紫杉醇含量进行了随机抽样调查。结果见表2。表2  云南红豆杉的枝叶中的紫杉醇含量（略）
       
       我们也对其进行了数据统计处理如图4，通过统计图我们可以清晰的发现这次实验中所调查的样品之间的差异性。
       3  讨论
       3.1  前处理步骤的选择和优化红豆杉类植物中的活性成分紫杉醇含量低，加上其他成分复杂，用甲醇多次超声处理，提取液杂质多，色谱峰彼此重叠，干扰严重，无法进行测定，故本实验利用紫杉醇在甲醇中易溶的特性，先采用了甲醇为提取剂，再将初提液用二氯甲烷进行了萃取，杂质有所减少，当所得萃取液最后通过氧化铝柱层析后，样品分离效果良好，其回收率、线性关系考察都有较理想的效果，实验结果表明效果很好。
       3.2  流动相的选择流动相的比例及流速，色谱柱的柱温对分离效果有直接影响，流动相中甲醇体积的大小直接影响到紫杉醇的出峰时间，甲醇比例增大，对物质的洗脱能力增强，紫杉醇的保留时间缩短，但与样品中其它杂质分离不好，甲醇比例减小，样品溶液中各个色谱峰分离度改善，但紫杉醇的保留时间延后，增加分析操作时间。经反复实验，确定了A相甲醇B相为水，梯度洗脱，既可使保留时间缩短，又可以取得良好的分离效果。
       3.3  样品结果讨论
       由表2可知，在本文中70个随机云南红豆杉枝叶样品中紫杉醇的含量有一定差别， 最小含量为60 mg/kg，最大含量为290 mg/kg ，平均含量达140 mg/kg，可见我国思茅地区人工种植的红豆杉具备提取紫杉醇的价值，有较高的开发利用价值，应进一步开展保护、培育和开发的研究。本方法的最低检测限为0.07 μg/kg,完全能满足检测需要。
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