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       【摘要】 
       目的建立高效液相色谱-蒸发光散射检测（HPLC-ELSD）法测定金银花中绿原酸及木犀草苷的方法。方法采用Chromasil C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5.0μm)为色谱柱，用乙腈(A)-0.5%冰醋酸(B) 为流动相梯度洗脱，以蒸发光散射检测器检测绿原酸和木犀草苷。梯度程序为：0 min(A：10%，B：90%)→16 min(A：25%，B：75%)→22 min(A：50%，B：50%)；流速1.0 ml·min-1；检测器漂移管温度110℃ ，载气流速3.0 ml·min-1。结果绿原酸及木犀草苷的回归方程分别为：lgA=1.34lgm + 4.360，r=0.999 5；lgA =1.653lgm + 5.327,r=0.999 6。线性范围分别为5.0～45 μg和0.4～3.6 μg；平均回收率分别为99.94%(RSD=1.43%，n=5)和100.85%(RSD=1.78%，n=5)。结论该方法操作简便、结果准确，专属性强，分离效果和重现性好，可有效缩短总分析时间。为较全面控制金银花药材的质量控制提供了简便可靠的方法。
       【关键词】  金银花 绿原酸 木犀草苷 高效液相色谱-蒸发光散射检测器 含量测定
       HPLCELSD Determination of Chlorogenic Acid and Galuteolin in Flos Lonicerae Japonicae
       KOR Banjhon, SU Wenqin, ZHANG Pengwei
       1. School of Biochemistry and Environmental Science，Ili Normal University，Xinjiang Yining 835000， China；
       2. 6th Chinese Medicine Factory of Tianjin Zhongxin Pharmaceutical Ltd. Co, Tianjin,300401,China；
       3. School of Pharmaceutical Science and Technology，Tianjin University，Tianjin 300072，China
       Abstract:ObjectiveTo develop a method for determination of chlorogenic acid(ChA) and galuteolin(Gal) in Flos Lonicerae Japonicae.MethodsAn HPLC equipped with ELSD method was applied to quantify chlorogenic acid and galuteolin．The analytical column was Chromasil C18(4.6 mm×250 mm,5.0μm)with the temperature of 30℃. The chromatogram for the ChA and Gal was developed on a gradient phase. Two solution were acetonitrile(A) and 0.5 % acetic acid solution and the gradient mode was as follows：0 min(A：10%,B：90%)→16min(A:25%,B:75%)→22 min(A：50%,B：50%). The flow rate was 1.0 ml·min-1．The temperature of drift tube was set at 110℃ and the flow rate of gas maintained at 3.0 ml·min-1．ResultsThe calibration curves of ChA and Gal were linear in the range of 5.0～45 μg and 0.4～3.6 μg，and the average recoveries were 99.94%(RSD was1.43%) and 100.85%(RSD was 1.78%) respectively．ConclusionThe method is  accurate，specific，and can shorten the total analytical time of Flos Lonicerae Japonicae．
       Key words:Flos Lonicerae Japonicae；  Chlorogenic acid；  Galuteolin；  HPLC-ELSD；  Determination
       
       金银花为忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.，红腺忍冬L. hypoglauca Miq.，山银花L. confusa DC.，或毛花柱忍冬L. dasystyla Rehd.的干燥花蕾或带初开的花［1］。金银花药用历史悠久，为常用的清热解毒药，具有清热解毒、散风消肿的功能，主治风热感冒、肺炎、咽喉肿痛、急性细菌性痢疾、婴幼儿腹泻等证［2，3］。其主要含有绿原酸、异绿原酸、挥发油、咖啡酸、黄酮、皂苷等［4］。绿原酸常作为金银花质量控制的指标成分。2005版《中国药典》金银花项下增加了木犀草苷的含量测定。因为绿原酸和木犀草苷的最大吸收波长不一致，所以需要分别用HPLC法测定绿原酸和木犀草苷的含量，增加了检测工作量。而研究表明对有紫外吸收的药物用UV法和ELSD法测定结果是一致的［5，6］。ELSD是一种通用型检测器，可以克服紫外检测器的以上缺点，因此本文采用ELSD检测器对其进行同时测定。结果表明此法准确，精密度、重现性好、回收率高，为金银花药材的质量控制提供了快速、准确的测定方法。
       1  仪器与材料
       1.1  仪器
       Agilent 1100高效液相色谱仪（美国，安捷伦公司）；Alltech 2000型蒸发光散射检测器（美国，Alltech公司）；WWK无油空压机(天津，兴国科技)；SB2200超声波清洗器(上海超声仪器厂)；METTL ER220电子天平(美国，梅特勒公司)。
       1.2  材料
       绿原酸（购于中国药品生物制品检定所，批号110753-200413），木犀草苷（购于上海郎中堂化剂公司，纯度大于98%）；从不同产地收集5批金银花样品，通过天津药物研究院张鑫新老师鉴定，天津、河南、山东产为忍冬Lonicera japonica Thunb.,陕西产为红腺忍冬L. hypoglauca Miq.，新疆产为山银花L. confusa DC.；水为饮用纯净水（杭州娃哈哈集团），冰醋酸(天津奥凯化工贸易有限公司)。其余试剂均为分析纯。
       2  方法与结果
       2.1  色谱条件与系统适用性试验 
       Kromasil C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱温30℃ ；梯度洗脱，流动相A为：乙腈，流动相B为：0.5%冰醋酸水溶液,梯度程序为：0 min(A：10%， B：90%)→16 min(A：25%，B：75%)→22 min(A：50%,B：50%)，每次重新开始梯度前，以0 min时比例流动相平衡10 min。流速1.0 ml·min-1；ELSD检测器参数为：漂移管温度110℃，气体流速3.0 ml·min-1。理论塔板数按木犀草苷峰计算不低于2 000，与相邻峰的分离度大于2.0。色谱图见图1。
       2.2  溶液的配制
       2.2.1  对照品溶液
        
       精密称取绿原酸及木犀草苷适量，分别置10 ml量瓶中，加甲醇溶解、定容，分别制成2.5 mg/ml的绿原酸标准溶液和0.2 mg/ml的木犀草苷标准溶液，置棕色瓶中备用。
       2.2.2  供试品溶液
        
       精密称取金银花干燥细粉(过60目筛)约5.0 g，加石油醚（60～90℃）40 ml，浸泡2 h，过滤，滤渣室温挥干石油醚，置于具塞三角瓶中，用40 ml（20 ml×2）70%乙醇超声提取两次，30 min/次，过滤，合并滤液，用70%乙醇溶液洗涤滤渣，将滤液60℃减压蒸干，用甲醇定量转移至5 ml容量瓶中，摇匀，取续滤液用0.45 μm微孔滤膜过滤即得。
       2.3  线性关系考察 
       分别精密吸取上述对照品溶液2，5，8，11，15，18μl，注入色谱仪，按上述色谱条件测定，以峰面积对数对对照品进样量对数进行线性回归，分别得绿原酸及木犀草苷的回归方程分别为：
       
       lgA =1.34lgm + 4.360，r=0.999 5；
       
       lgA =1.653lgm + 5.327，r=0.999 6，
       
       线性范围分别为5.0～45 μg和0.4～3.6 μg。
       2.4  提取方法考察
       精密称取金银花药材粉末约2.0 g，用加石油醚（60～90℃）20 ml脱脂，置具塞三角瓶中，分别用80 ml 70%乙醇、甲醇超声提取两次（20 ml×2）或1次（40 ml×1），30 min/次，过滤，合并滤液，用相应溶液洗涤滤渣，将滤液60℃减压蒸干，用甲醇定量转移至2 ml容量瓶中，摇匀，滤过，取续滤液，取10 μl进样分析，比较色谱峰面积大小。结果表明以40 ml 70%乙醇超声提取两次（20 ml×2）即能完全提取绿原酸和木犀草苷。
       2.5  方法学考察
       2.5.1  精密度实验
       精密吸取同一样品溶液，连续进样5次，10 μl/次，测定峰面积，绿原酸和木犀草苷峰面积的RSD(n=5)值分别为0.73%和0.84%。表明仪器精密度良好。
       2.5.2  重复性实验
       精密称取药品粉末2.0 g共5份，按“2.2.2”项下方法制备，并按“2.1”项下条件进行测定, 计算含量。绿原酸和木犀草苷的RSD(n=5)值分别为1.27%和1.65%。
       2.5.3  稳定性实验 
       取同一批供试品溶液，室温避光放置，分别于0，2，4，8，12，24 h进行测定，结果绿原酸、木犀草苷峰面积的RSD(n=6)分别为1.72%，0.54%；表明供试品溶液在24 h内稳定。
       2.5.4   回收率实验
       精密称取5份已重复测定的金银花药材粉末1.0 g，分别精密加入绿原酸和木犀草苷对照品溶液适量，按“2.2”项下方法测定含量，计算回收率。结果见表1～2。表1  绿原酸的加样回收率测定结果（略）表2  木犀草苷的加样回收率测定结果（略）
       2.6  样品测定不同产地的样品按上述方法制备样品溶液，按含量测定项下的色谱条件进行测定，每个产地样品平行测定3次，取峰面积平均值，按标准曲线计算不同产地金银花中绿原酸和木犀草苷含量。结果见表3。
       表3  样品含量测定结果（略）
       3  讨论
       蒸发光散射检测器可以检测任何挥发性比流动相小的化合物，因此其适应性比UV检测器要广，但其灵敏度比UV要低约一个数量级［4，6］。金银花中木犀草苷的含量相对较低，因此本文采用加大样品浓度的方法来克服ELSD灵敏度低的缺点。为了使待测物提取完全，将《中国药典》里的一次提取改为分两次提取，在使用相同量的溶剂条件下提高了提取效率。
       从本实验色谱图可以看出在流动相组分发生变化的阶段，色谱图的基线依然比较平坦，这是因为ELSD检测器是利用样品蒸发所形成的气溶胶引起的光散射而产生信号的，只要仪器漂移管温度足够高，载气足够大，就可避免产生溶剂信号，避免对样品的干扰。而通用的UV检测器中流动相组分变化时会引起光折射引起基线不稳，因此利用ELSD检测有可能进行较大梯度的流动相切换以缩短分析时间。
       由于金银花的产地不同，其绿原酸和木犀草苷含量也不同，但测定结果表明，各样品中的绿原酸和木犀草苷含量均符合2005年版《中国药典》Ⅰ部规定［1］。
       【参考文献】
         　　［1］国家药典委员会.中国药典,Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社，2005：152.
       
       ［2］武晓红，田智勇，王 焕.金银花的研究新进展［J］.时珍国医国药，2005，16(l2)：1303.
       
       ［3］石 钺，石任兵，陆蕴如.我国药用金银花资源、化学成分及药理研究进展［J］.中国药学杂志，1999，34(11)：724.
       
       ［4］乔成孝，裴朝玉，陈晓刚，等.HPLC-UV与HPLC-ELSD测定环丙沙星含量之比较［J］.现代仪器,2006，12（6）：29.
       
       ［5］孙毓庆.现代色谱法及其在医药中的应用［M］.北京：人民卫生出版社，1998：205.
       
       ［6］张尊建，于 静.忍冬、山银花HPLC/UV/MS指纹图谱研究［J］.中成药，2003，11(25)：863.