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       【摘要】 
       目的观察中药龟鹿益髓胶囊对实验性脑脊髓炎的发病情况、脾T淋巴细胞增殖、血中IL2，IL4，IL6，TNFα的影响。方法该实验采用豚鼠脊髓匀浆和完全福氏佐剂制成的抗原-佐剂乳化液诱导大鼠EAE动物模型，应用龟鹿益髓胶囊作为治疗药物，以泼尼松作为对照药物，观察脑脊髓炎大鼠发病情况，T淋巴细胞增殖及血清中IL2，IL4，IL6，TNFα的水平。结果龟鹿益髓胶囊能明显抑制EAE发病，减轻其病情，同时对MBP诱导的脾T淋巴细胞增殖，血清IL2，IL6，TNFα活性有明显抑制作用，对ConA诱导脾淋巴增殖，IL-4具有增强作用。结论龟鹿益髓胶囊对ConA诱导的T淋巴细胞增殖有增强作用，而对MBP诱导的T淋巴细胞增殖具有抑制作用。而泼尼松片对两者诱导T淋巴细胞增殖均有抑制作用。大剂量龟鹿益髓胶囊能抑制IL2，IL6，增强IL4的活性，调节免疫功能，从而抑制EAE发病，提示中药龟鹿益髓胶囊通过调节体内紊乱的免疫功能起到治疗作用。
       【关键词】  实验性脑脊髓炎 龟鹿益髓胶囊 发病情况 T淋巴细胞增殖 细胞因子
       多发性硬化(multiplesclerosis，MS)是一种T细胞介导的中枢神经系统脱髓鞘疾病，好发于20～40岁的青壮年女性，致残率高，复发率高，给社会、家庭和个人造成了极大的经济和心理负担。现代研究已经发现本病患者脑内广泛存在髓鞘特异性T淋巴细胞，活化的T淋巴细胞通过血脑屏障（BBB），可分泌多种细胞因子，这些细胞因子再通过免疫机制或直接作用导致髓鞘的脱失，而引起脑和脊髓的炎症反应和脱髓鞘变化［1］。
        本实验中通过中药龟鹿益髓胶囊对MS模型(Experimental Autoimmune Encephalomyelitis , EAE )-脑脊髓炎发病情况、脾T淋巴细胞增殖、血清中IL2，IL4，IL6，TNFα的影响，来探讨本药治疗MS的药效学研究。
       1  材料与方法
       1.1  动物健康wistar大鼠，清洁级，雌性，70只，体重180～200 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证编号：SCXK（京）2002-2003。健康DH豚鼠，清洁级，雌性40只，体重250～350 g，购于河北省实验动物中心，许可证编号SCXK（冀）2003-1-003。
       1.2  试剂及药物完全福氏佐剂ConA，3H-TdR，MBP，美国Sigma生产。IL-2，IL-4，IL-6，TNF-α放免试剂盒购于北京301医院放免研究所；龟鹿益髓胶囊，由石家庄以岭药业股份有限公司提供；泼尼松片（阳性药），由浙江仙琚制药股份有限公司提供。
       1.3  实验分组及给药将70只健康的雌性wistar大鼠随机分为6组，分别为空白对照组10只，模型对照组、泼尼松片组、龟鹿益髓胶囊大剂量（10.24 g生药/kg）、中剂量（5.12 g生药/kg）、小剂量（2.56 g生药/kg）组，每组各12只。按照文献复制脑脊髓炎模型［2］。取新鲜豚鼠，麻醉处死，取出脊髓，除去基膜，称重后放入组织研磨器，加入等量的生理盐水研磨成50%的豚鼠脊髓匀浆液。将等体积的脊髓匀浆和完全福氏佐剂充分乳化，形成油包水乳剂，卡介苗的终浓度为6 mg/ml。空白组乙醚麻醉后4个足垫及背部共5个部位，每个部位0.1 ml，共0.5 ml；模型组乙醚麻醉后在同样部位注射抗原乳剂。实验日计为0 d，以后每天称重并观察病情变化，时间为1个月。
       1.4  观察方法
       1.4.1  观察发病情况观察各组动物的发病潜伏期、体重损失情况、发病率、死亡率、症状体征等，症状体征参考文献［3］评分：0为正常；1为尾无力；2为后肢无力；3为单侧后肢麻痹；4为双侧后肢麻痹；5为双侧后肢麻痹和尿失禁。30 d后对致死率、发病率、发病潜伏期、症状评分、体重进行综合评价。
       1.4.2  检测脾淋巴细胞增殖情况各组大鼠断头处死后，无菌摘取脾脏，分离成单个细胞。96孔细胞培养板每孔加入用20%小牛血清RPMI1640（Gibco公司）液含5×106/ml的大鼠脾淋巴细胞悬液100 μl，然后加入用RPMI1640液稀释的2 μg/ml的ConA100 μl，或10 μg/ml的MBP100 μl［4］，每组设复孔12个。放37℃，5% CO2和饱和湿度孵温箱培养56 h，分别向每孔加入以RPMI1640液配制的10μl（370 KBq）/ml 3H-TdR（北京原子高科核技术应用股份有限公司）20 μl（7.4KBq）继续培养16 h。用Herveste在96型细胞收集仪（Tomte公司）收集样品于1450-421型滤纸膜垫A（Perkin Elmer公司）上，放80℃，20 min烘干后，装入1450-423型MicroBeta样品袋中，加入闪烁液后往wallac 1295-0120型热封机封闭放固定架内，置MicroBeta tritux 1450型微量液闪仪（perkin Elmer公司）中，检测（计数）每孔样品的放射性强度，以cpm值表示。
       1.4.3  采血检测IL-6，IL-2，IL-4，TNF-α活性每只发病动物均于濒死状态下处死，空白对照组及发病后未死亡动物及未发病动物于4周后处死。每只动物于处死前均先麻醉，无菌操作心脏采血3 ml只，将采取血液经低温冷冻离心机离心取血清，然后用全自动C-计数仪分别检测IL-2，IL-6，IL-4，TNF-α (具体步骤按照放免药盒说明书操作)。
       1.5  统计方法
       应用美国Stata 4.0版软件对发病潜伏期、体重损失、症状体征、症状评分、T淋巴细胞增殖、细胞因子进行单因素方差分析，对发病率和死亡率进行χ2检验。
       2  结果
       2.1  各组动物临床发病情况空白对照组10只大鼠没有发病且体重呈持续增加，毛色光亮，活动正常，食欲较好。模型组大鼠发病时出现毛色变暗、体重下降、尾部无力下垂、后肢瘫痪等临床症状，并有大小便失禁，甚至死亡，和预实验结果相同，证明模型复制是成功的。各给药组大鼠症状有不同程度的改善。见图1～4。
       2.2  龟鹿益髓胶囊对EAE大鼠发病率、潜伏期、最高评分和致死率的影响各组最高症状评分、潜伏期比较。泼尼松片组最高症状评分降低，与模型组比较（P<0.01），发病潜伏期有延长的趋势。龟鹿益髓胶囊小剂量组大鼠发病潜伏期延长与模型组比较（P<0.05），最高症状评分有降低的趋势；龟鹿益髓胶囊大、中剂量组发病潜伏期延迟（P<0.01），最高症状评分降低（P<0.01）。 结果见表1。表1  龟鹿益髓胶囊对EAE大鼠发病率、潜伏期、最高评分和致死率的影响（略）
       2.3  龟鹿益髓胶囊对脑脊髓炎大鼠T淋巴细胞增殖的影响在ConA诱导下，模型组淋巴细胞转化降低，泼尼松组淋巴细胞转化降低，龟鹿益髓胶囊组淋巴细胞转化升高，和模型组相比有显著性差异（P<0.01）；在MBP诱导下，模型组淋巴细胞转化升高，泼尼松组淋巴细胞转化率较模型组降低，龟鹿益髓胶囊组淋巴细胞转化率降低，和模型组比较有显著性差异（P<0.01）。结果见表2。
       2.4  龟鹿益髓胶囊对EAE大鼠IL-6，TNF-α，IL-2，IL-4的影响模型组血清中TNF-α，IL-2和IL-6升高，IL-4降低；泼尼松片组TNF-α，IL-2和IL-6降低，IL-4升高，和模型组比较有显著性差异（P<0.01）；龟鹿益髓胶囊小剂量组各项指标较模型组有一定程度的改善，但无显著性差异（P>0.05）；中剂量龟鹿益髓胶囊可升高IL-4，抑制血清IL-2，IL-6的活性，与模型组比较有统计学意义（P<0.05）；大剂量龟鹿益髓胶囊抑制EAE大鼠血清中IL-2，IL-6的活性，升高IL-4，和模型组比较，有差异或显著性（P<0.05或 P<0.01）。结果见表3。
       3  结论
       ConA刺激T细胞增殖能力代表机体正常的免疫功能，实验中ConA刺激的EAE模型大鼠多克隆T细胞增殖能力显著低于正常组，而MBP诱导的特异性T细胞的增殖却显著高于正常组，这说明EAE模型大鼠整体免疫功能，即正常的免疫功能是低下的，而针对MBP的特异性T细胞增殖是异常增高的。实验结果发现龟鹿益髓胶囊对ConA诱导的T淋巴细胞增殖有增强作用，而对MBP诱导的T淋巴细胞增殖具有抑制作用。而泼尼松片对两者诱导T淋巴细胞增殖均有抑制作用，表明中药龟鹿益髓胶囊和西药泼尼松片对本病治疗的部分作用机制是不同的。
       近年来许多研究表明，细胞因子参与神经系统的免疫调节，与MS发病密切相关。IL-2，IL-4，IL-6，TNF-α在机体免疫反应中起重要作用， IL-2，IL-6，TNF-α是MS正调节因子，IL-4是负调节因子，它们之间具有密切联系，均参与MS免疫反应，影响MS的病情变化。本实验观察发现，EAE模型大鼠体内细胞因子的分泌处于一种紊乱状态，IL-2，TNF-α，IL-6异常增高， IL-4异常降低，出现了免疫偏离现象。可见EAE的发生正是Th细胞平衡的破坏，通过调节分化后细胞因子水平，平衡Th细胞活化，校正有害的免疫偏离，是治疗的一个途径。通过治疗后发现龟鹿益髓胶囊可减轻EAE发病动物的体重损失，抑制血清IL-6，TNF-a，IL-2的活性；大剂量龟鹿益髓胶囊可明显延长EAE动物的发病潜伏期，减轻动物的体重损失和临床症状，明显抑制EAE豚鼠血清IL-6，TNF-α，IL-2的活性，增强IL-4的活性，从而对紊乱的免疫功能有调节作用，减轻EAE的发病和病情的严重程度。表2  龟鹿益髓胶囊对EAE大鼠T淋巴细胞增殖的影响（略）表3  龟鹿益髓胶囊对EAE大鼠血清中IL-4，IL-2，TNF-α，IL-6的影响 (略)
           
       MS临床多见肢体无力，行走不稳，甚者瘫痪。根据其临床症状，属祖国医学的“痿证”范畴，并从肾、督脉和络脉论治，认为本病是肾精亏损，络脉瘀滞所致，针对其发病病机我们制定了填精益髓，充督活络治疗原则并研制成功中药复方-龟鹿益髓胶囊。本制剂由人参、鹿茸、龟版、菟丝子、何首乌、鸡血藤、黄芪、生地等药组成。目前多数学者认为，多发性硬化存在免疫功能调节障碍，现代药理研究证明上述诸药可从不同方面调节免疫功能。人参能促进ConA 和LPS诱导的小鼠外周血和脾脏淋巴细胞数量增殖［5，6］。人参根总皂苷具有佐剂作用，能明显提高机体的细胞免疫［7］和体液免疫［8］功能，且没有常规佐剂的局部刺激作用。在细胞因子免疫方面人参皂苷改善脾脏淋巴细胞IL-2的生成能力，可以明显提高淋巴细胞分泌IL-4 mRNA转译IL-4；鹿茸提取物能明显增强腹腔巨嗜细胞吞噬功能；何首乌可显著增强刀豆素A诱导的胸腺和脾脏T淋巴细胞增殖反应，提高淋巴细胞转化率［9］。本实验观察发现，龟鹿益髓胶囊治疗组各项指标较模型组明显好转，说明龟鹿益髓胶囊通过调节机体的免疫功能而对多发性硬化起到积极的治疗作用。
       【参考文献】
         　　［1］吕雪莹，张凤蕴，王丽群，等.实验性变态反应性脑脊髓炎的病理研究［J］.中国神经免疫学和神经病学杂志，2000，7（1）：49.
       
       ［2］刘晓艳，孙 怡. 补肾固髓片治疗多发性硬化的临床与实验研究［J］.中国中西医结合杂志2001，21（1）：12.
       
       ［3］Legge K L，Min B，Bell J J, et al.Coupling of peripheral tolerance to endogenous interleukin 10 promotes effective modulation of myelin-activated T cells and ameliorates experimental allergic encephalomyelitis［J］.J Exp Med,2000，191(12):2039.
       
       ［4］Inoue A，Koh CS， Shimada K， et al. Suppression Cell-tansferred experimental autoimmune encephalomyelitis in defibrinated Lewis rats［J］.J Neuroimmunol，1996， 71：131.
       
       ［5］李凌夫，王曾力，张 燕，等.人参皂甙Rc对正常成人外周血NK及LAK细胞活性影响的实验研究［J］.中医药信息，1996,2：52.
       
       ［6］李凌夫，王 冬，张 燕，等. 人参皂甙RE对正常成人外周血LAK和NK细胞活性影响的实验研究［J］.中医药信息，1996，3：54.
       
       ［7］Hu S, Concha C, CooRay R, et al. Ginseng-enhanced oxidative and phagocytic activities of polymrphonuclear leucocytes from bovine peripheral blood and stropping milk［J］. Vet.Res，1995，26：155.
       
       ［8］Hu S, Conaha C，Johannisson A，et al. Effect of subcutaneous injection of ginseng on cows with subclinical Staphylococcus aureus mastitis［J］. J. Vet. Med. B，2001，48：519.
       
       ［9］李仪奎，姜名英.中药药理学，第1版［M］.北京：中国中医药出版社，1992：181，197，198.