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       【摘要】 
       目的研究黄芩苷对人肝癌细胞系 SMMC7721 的生长抑制作用并初步探讨其作用机制。方法采用 MTT 法检测黄芩苷对人肝癌 SMMC7721 细胞株增殖的抑制作用，并采用流式细胞技术检测其对 SMMC7721 细胞周期的影响。结果① 4 ～0.005 312 5 mg/ml黄芩苷组对 SMMC 7721 肿瘤细胞生长均具有明显抑制作用，与细胞组对照比差异有显著性（P＜0.05或P＜0.01）。0.5～0.062 5 mg/ml 黄芩苷组肿瘤生长抑制率与其他浓度组比差异有显著性（P＜0.01），与顺铂对照组比较，差异无显著性（P＞0.05）。当黄芩苷浓度为0.5 mg/ml 时，其对肿瘤细胞的生长抑制率最高，为63.8%；② 0.5 mg/ml 黄芩苷对SMMC7721肿瘤细胞形态的损害作用最明显，可见60%～70%的细胞呈碎片样，少数细胞呈悬浮生长；③ 0.5 mg/ml 黄芩苷能够使细胞组滞于G0/G1期（G0/G1 期细胞为72.19%）。结论黄芩苷对 SMMC 7721 细胞生长具有明显抑制作用，且可影响其细胞增殖周期。
       【关键词】  黄芩苷 抗肿瘤作用
       An Experimental Study on Inhibitory Effect of Baicalin on Human Hepatic Carcinoma Celline SMMC7721 in Vitro
       KUANG Nanzhen,FU Yingyuan,HUANG Binhong,ZHOU Zhixing,ZENG Xiaoping
       1.Medical College of Nanchang University,Nanchang, Jiangxi 330006,China;
       2.Gannan Medical College,Ganzhou, Jiangxi 341000,China;3.Yichun Medical College,Yichun, Jiangxi 336000,China
       Abstract：ObjectiveTo investigate the inhibitory effect of baicalin on the growth of human hepatic carcinoma cell line SMMC 7721 in vitro and discuss its mechanism.MethodsThe inhibitory fraction of SMMC 7721 cells was measured by MTT assay,and flow cytometry was used to determine the effect on cell cycle.Results①.Baicalin in a concentration range of 4～0.005 312 5 mg/ml had remarkable inhibitory effect on the growth of SMMC 7721 in vitro, and had statistically significant difference in comparison with cell control guoup(P＜0.05).Tumor inhibition percentage of concentration 5～0.062 5 mg/ml  had statistically significant difference in comparison with that of other concentration groups of baicalin(P＜0.01),and had no significant difference in comparison with DDP control group(P＜0.05). Concentration of 0.5 mg/ml had the highest inhibitory effect on the growth of SMMC 7721 in vitro,and the tumor inhibition rate was 63.8%.②After treatment of 0.5 mg/ml baicalin, there was a remarkable damage on SMMC 7721 cancer cell.A lot of cell fragments were observed on 60%～70% cells and a few cells shed and suspended in the medium.③Baicalin of 0.5 mg/ml had effect on arresting cell cycle of human hepatic carcinoma celline SMMC 7721 at G0/G1  phase.(Percentage of the cell at  G0/G1 phase is 72.19%)ConclusionBaicalin has inhibitory effect on the growth of SMMC 7721 in vitro and it has effect on cell cycle. 
       Key words：Baicalin；  Arti-tumor
       肿瘤是威胁人类健康的重大疾病，随着癌症对人类健康威胁，开发治疗此类疾病的化学合成药物耗资巨大，且从化学合成物中寻找抗癌药的难度较大，为此科学家把目光投向植物、矿物等绿色天然药物或其衍生物。从植物中寻找抗癌药，已成为国内外抗癌药物研究的重要组成部分。黄芩苷是从黄芩中分离出来的黄酮类化合物，是黄芩的主要有效成分，具有多种药理作用，可抗氧化、清除自由基、抗炎、增强机体免疫功能、抗病毒，抗菌等，对免疫、心脑血管、消化、神经等系统均有保护作用［1～6］。因此，黄芩苷在临床医疗上有着重要的作用。近年来的研究表明，其对肿瘤有细胞毒作用。为了解黄芩苷对肝癌的作用，本研究选用人肝SMMC7721细胞株，以观察黄芩苷对其的作用，并通过分析细胞周期来揭示黄芩苷抑制肝癌细胞增殖和诱导肝癌细胞凋亡的可能机制。
       1  材料与方法
       1.1  材料
       1.1.1  肿瘤细胞株人肝癌 SMMC 7721 细胞株购自江西省医学科学研究所。
       1.1.2  黄芩苷由江西省中医药研究院熊学敏教授提供，黄芩苷用pH  6.0 PBS 配制成检测浓度。
       1.1.3  试剂
       碘化丙啶，核糖核酸酶，RPMI -1640，小牛血清，胰蛋白酶，MTT，DMSO，盐酸阿霉素，顺铂。
       1.2  方法
       1.2.1  黄芩苷体外抑癌实验MMT法。
       1.2.1.1  肿瘤细胞株悬液的制备人肝癌SMMC7721细胞按常规方法，置于RPMI1640完全培养液中（含10%胎牛血清），于37℃，5%CO2和充分湿度条件下的恒温培养箱中培养，2 d传代1次，取对数生长期的癌细胞株，收集细胞（贴壁细胞用 0.25% 的胰蛋白酶消化后收集），并用 RPMI1640 完全培养液调整浓度，配制成1×105/ml的单细胞悬液。
       1.2.1.2  体外抑瘤实验将肿瘤细胞株悬液接种与 96 孔平底细胞培养板，每孔100 μl 37℃5%CO2培养后，实验孔加入100 μl 含不同浓度黄芩苷的培养液，使终浓度为 0.031 25 ，0.062 5，0.125，0.25，0.5，1，2，4 mg/ml，实验阳性对照孔为顺铂、阿霉素，阴性细胞对照孔用培养液，空白孔用培养液以调零，各组 6 个平行孔，37℃，5%CO2培养箱中培养 48 h，实验终止前4 h加入5mg/ml 的 MTT 20 μl ，继续培养4 h，吸出上清液 200 μl ，加入 DMSO 终止反应，室温下振荡10 min，待孔内结晶物溶解后，用空白孔调零，于490 nm 波长处在酶标仪上测定各孔吸光值（OD 值），各重复孔的吸光值取平均值，按下列公式求出生长抑制率。
         
       生长抑制率 IR（%）=1-用药组平均 OD 值阴性对照组平均值 OD 值×100%
       1.2.2  黄芩苷对
       SMMC 7721 细胞形态及细胞周期分布的影响
       1.2.2.1  黄芩苷对
       SMMC 7721 细胞形态的影响SMMC 7721 肿瘤细胞株按常规方法培养传代，取对数生长期的癌细胞株，胰蛋白酶消化后收集，用 RPMI1640 完全培养液配制成1×105/ml的单细胞悬液，将肿瘤细胞株悬液接种于培养瓶中，37℃，5%CO2培养4 h后，加入不同浓度黄芩苷溶液，终浓度为 0.031 25，0.062 5，0.125，0.25，0.5，1，2，4 mg/ml ，细胞对照加入培养液，阳性对照为阿霉素组，37℃，5%CO2培养48 h，于倒置显微镜下观察细胞形态变化。
       1.2.2.2  流式细胞仪检测黄芩苷对 SMMC 7721 细胞周期的影响［7］SMMC 7721 肿瘤细胞株处理：方法同前，黄芩苷浓度为 0.5，2mg/ml，取37℃，5%CO2培养 48h 后的 SMMC 7721 肿瘤细胞株，用0.25%的胰蛋白酶消化，pH 7.4 PBS 洗涤后，调整细胞浓度为1×106个/ml，加入PI碘化丙啶综合染液避光染色30 min，用300目尼龙网过滤，上流式细胞仪分析细胞（参数）周期分布，采用 ModFit 软件分析结果。
       1.3  统计学方法
       计量指标用±s表示，多样本均数比较用单因素方差分析（ANOVA），有统计学意义再进行 SNK 法两两比较。采用SPSS11.5 软件统计。
       2  结果
       2.1  黄芩苷体外抑瘤实验采用 MTT 法观察了不同浓度的黄芩苷对体外培养的SMMC 7721 肿瘤细胞株增殖作用的影响，结果见表1。表1  黄芩苷对SMMC7721细胞增殖的影响(略)
       各浓度黄芩苷组对 SMMC 7721 细胞生长具有明显抑制作用，与细胞对照组差异呈显著性（P＜0.01或P＜0.05）。0.5～0.062 5 mg/ml 黄芩苷组肿瘤生长抑制率与其他浓度差异呈显著性（P＜0.01），与顺铂对照组比较，差异无显著性（P＜0.05）。且当黄芩苷浓度为 0.05 mg/ml 时，其对肿瘤细胞的生长抑制率最高，为63.8%。
       2.2  黄芩苷对 SMMC 7721 细胞形态及细胞周期分布的影响
       2.2.1  黄芩苷对 SMMC 7721 细胞形态的影响倒置显微镜下观察发现，细胞对照组细胞呈多边形，生长状况良好，细胞在倒置显微镜下观察时透明度大，折光性强，胞质均匀，轮廓不清。4 mg/ml 黄芩苷作用 SMMC 7721 细胞后，细胞贴壁能力明显下降，许多细胞脱落成单个漂浮生长状态，约有60%～70%的细胞呈悬浮生长；0.031 25 mg/ml 黄芩苷作用 SMMC 7721 细胞后，细胞贴壁能力稍下降，细胞稍变小，大多数细胞呈多边形，贴壁生长，少数细胞脱落；0.5 mg/ml 黄芩苷对细胞的影响最大，可见约有60%～70%的细胞，呈碎片样，少数细胞呈悬浮生长，未见贴壁细胞。
       2.2.2  黄芩苷对 SMMC 7721 细胞生长周期的影响黄芩苷对癌细胞增殖周期G2-M期细胞作用不大，但能使G0-G1  细胞增多，使S期细胞减少，如表2所示。表2  黄芩苷对SMMC7721细胞生长周期的影响（略）
       3  讨论
       从传统中药中发现并证实抗肿瘤药物的作用及其机理，是目前国内医药研究的热点之一，在积极发展民族药物研究的过程中，从植物中寻找抗肿瘤药，致力于寻找药用植物新的药用价值，并加以改进，不仅其开发具有巨大潜力，还能为设计更理想的新药提供化学结构独特的先导化合物。
       黄芩苷是中药黄芩中的主要活性成分，是黄芩及其制剂的主要质量控制指标。临床上许多清热解毒、抗菌消炎的中成药都含有黄芩苷。近年来的研究表明，黄芩苷对多种肿瘤具有抗瘤活性。采用MTT法测得的1.0 mg/ml 黄芩苷组对C6 胶质瘤细胞抑制率（25.33%）比流式细胞仪测得的肿瘤细胞凋亡率（22.97%）要高，说明黄芩苷除了具有使 C6 细胞凋亡作用外，还有其他杀伤肿瘤作用［3］ 。Ciesielska E［8］ 观察到黄芩根的提取物（黄芩苷和黄芩素）对白血病 HL-60 细胞的杀伤作用比顺铂和阿霉素作用明显。采用 EAC 小鼠腹腔给药，用无色孔雀绿方法测定腹水中的脂加氧酶活性，同时，采用测定血清溶菌酶及T淋巴细胞非特异性酯酶染色法结果显示，给药组小鼠的溶菌酶活性及淋巴细胞酸性非特异性酯酶阳性率增加，体内、外艾氏腹水瘤细胞生长受抑制。证实黄芩苷增强了小鼠的体液和细胞免疫功能，能抑制荷瘤小鼠腹水脂加氧酶活性，抑制艾氏腹水瘤细胞的生长，但无论是在体内还是体外，对生长后期的瘤细胞抑制作用不明显。Shinichi I［9］研究了黄芩及其化合物黄芩素、黄芩苷、汉黄芩苷对膀胱癌细胞的抗肿瘤作用。结果证实，所有药物均可抑制癌细胞的增殖，且存在量效依赖关系，黄芩素表现出最大的抗增殖活性。在活体实验中，小鼠每天每只口服黄芩苷10 mg ，可显著抑制肿瘤增长，预示中草药可能成为治疗膀胱癌的有潜力和有前途的药物。
       原发性肝癌具有恶性程度高、发展快、生存期短等特点，本实验选用由人原发性肝癌建立起的细胞株 SMMC 7721 为体外研究对象，探讨了黄芩苷的抗肿瘤作用。本实验黄芩苷在 4～0.005 312 5 mg/ml 浓度范围对体外培养的 SMMC 7721 肿瘤细胞生长具有明显抑制作用，各浓度组与细胞对照组差异呈显著性（P＜0.05），当黄芩苷浓度为 0.5 mg/ml 时，其对肿瘤细胞的生长抑制率最高，为 63.8 %，且通过观察细胞形态的改变，可看到0.5 mg/ml黄芩苷对细胞的损害作用最明显，可见约有 60%～70% 的细胞，呈碎片样，少数细胞呈悬浮生长。0.5～ 0.062 5 mg/ml 黄芩苷组肿瘤生长抑制率与顺铂对照组比较，差异无显著性（P＞0.05）。顺铂的副作用病人较难耐受，而黄芩苷为中药活性成分，其毒副作用小，可为临床肿瘤治疗开辟一条新的治疗途径。
       肿瘤的生长、繁殖最显著的特征是生长失控和不分化，各种原因导致细胞周期调控的失衡会使细胞生长失控而出现肿瘤，因此，可通过对细胞周期有序地调控以达到抑制生长、增殖的目的。同时肿瘤也是细胞凋亡异常性疾病。细胞凋亡异常在大多数恶性肿瘤的发病学中占有重要的地位。处于增殖周期中的细胞，细胞周期调控点包括 G0-G1 ，S， G2/M 。为进一步探讨黄芩苷抗肿瘤的机制，我们采用流式细胞术检测黄芩苷作用后 SMMC 7721 肿瘤细胞。
       本实验应用流式细胞技术对肿瘤细胞的 DNA 二倍体分析结果显示，黄芩苷使 SMMC 7721 肿瘤细胞增殖周期G0-G1 期细胞增多，占72.19%，而 S期及 G2/M 期细胞则相应减少，提示黄芩苷能够使细胞阻滞与 G0-G1  期，使进入 S 期、M 期细胞比例降低，从而印证黄芩苷可通过影响细胞周期进程来抑制细胞增殖。
       【参考文献】
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