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       【摘要】 
       目的探讨开心散对衰老小鼠的高级糖基化终末产物（AGEs）和自由基的抑制作用。方法建立D-半乳糖诱导的亚急性衰老模型，用开心散进行治疗，观察其对衰老模型小鼠脑、肝脏的高级糖基化终末产物（AGEs），SOD活力以及MDA含量的影响。结果开心散能够明显改善D-半乳糖诱导的衰老小鼠的学习记忆障碍，显著提高衰老小鼠的脑、肝脏中SOD的活力，降低AGEs，MDA的含量。结论 开心散可能通过降低体内AGEs的含量以及清除自由基的作用来改善D-半乳糖诱导小鼠的学习记忆能力。
       【关键词】  开心散 高级糖基化终末产物 抗氧化 学习记忆
       Inhibitory Action of Kaixin Powder on Nonenzymatic Glycosylation and Free Radicals in Aging Rat Induced by D-gal
       ZHOU Gaochao, WANG Hua, WANG Yidan, GAO Xiangdong
       (School of Life Science and Technology, China Pharmaceutical University, Nanjing 210009,China)
       Abstract:ObjectiveTo study the effects of Kaixin Powder on nonenzymatic glycosylation and free radicals in aging rat. MethodsMimetic dementia model induced by D-galactose was used, and the ability of learning and memory was measured by water maze task. The contents of AGEs and MDA as well as activities of SOD in brains and livers were determined. ResultsThe results showed that Kaixin Powder could increase the correct percentage in the water maze task. Meanwhile it was found that Kaixin Powder markedly elevated SOD activity, and could reduce AGEs and MDA contents in brain and liver. ConclusionKaixin Powder may exhibit its anti-aging effects by, at least partially, inhibiting nonenzymatic glycosylation and reducing free radicals.
       Key words:Kaixin Powder;   AGEs;   Antioxidative;   Learning and memory abilities
       
       开心散（KXS）是古代医籍《备急千金要方》所记载的益智类方剂之一，经过古人长期的临床实践，证实有良好的益智作用。近年的研究表明，非酶糖基化和自由基在衰老的发生发展中具有协同作用，因此同时拮抗非酶糖基化和自由基以切断它们之间的恶性循环，成为抗衰老研究的一个新的突破点。D-半乳糖诱导的衰老小鼠模型可以显著增加小鼠体内血清AGEs含量，降低SOD活力等［1］，因此，我们以开心散研究对象，通过测定小鼠体内高级糖基化终末产物和自由基水平，阐明开心散抗衰老的可能机制。
       1   材料
       1.1  药物
       开心散由人参、远志、菖蒲、茯苓4味药组成。药材均购于南京市药材公司，经中国药科大学中药资源学教研室秦民坚教授鉴定符合药用规定。开心散按照人参10 g，远志10 g，菖蒲10 g，茯苓20 g的比例混合后，加9倍重量的水提取两次，1 h/次，两次水提液合并后减压浓缩至干，使用时用蒸馏水稀释至所需浓度。
       1.2  试剂
       D-半乳糖（D-Galactose，D-gal）上海试剂二厂，批号050719；脑复康（NFK），南京白敬宇制药有限公司，批号050811；超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒、丙二醛（MDA）试剂盒，南京建成生物工程研究所提供。
       1.3  仪器
       四盲端六折角小鼠水迷宫，荧光分光光度计(Cary Eclipse)，均由东南大学公共卫生学院提供。
       1.4  动物
       雄性昆明种小鼠18～22 g，由中国药科大学动物中心提供。
       2  方法与结果
       2.1  分组造模及给药
       小鼠随机分成6组，每组12只，即正常对照组，模型组，脑复康组（0.4 g/kg），开心散高剂量组（0.9 g/kg）、中剂量组（0.3 g/kg）、低剂量组（0.1 g/kg）。每日灌胃1次，除正常对照组每日腹腔注射等容量无菌生理盐水外，其余各组每日腹腔注射3.75% D-gal 150 mg/kg，连续6周［2］。
       2.2  学习记忆能力测试 
       结果表明，D-半乳糖模型组小鼠记忆能力明显降低，表现为在水迷宫内反应错误次数与游抵平台的时间较正常对照组显著增加（P< 0.01），阳性药脑复康组以及开心散高，中，低3个剂量都有明显的改善作用，而各用药组之间无显著性差异。结果见表1。表1  开心散对D-半乳糖模型小鼠在水迷宫试验中学习记忆能力的影响(略)
       2.3  脑、肝脏AGEs含量的测定
       行为学实验结束后第2天，摘取全脑、全肝，用无菌生理盐水制备10%的脑匀浆和肝匀浆，3 000 r/min离心10 min，取上清液测定脑和肝脏的AGEs含量［3］，激发波长和发射波长分别采用340 nm和430 nm，荧光相对强度以任意荧光单位/毫克蛋白表示，结果表明，模型组小鼠脑、肝脏的AGEs含量显著升高，而开心散中、高剂量能够显著降低脑、肝脏AGEs含量的增加。结果见表2。表2  开心散对D-半乳糖模型小鼠脑、肝脏AGEs含量的影响 (略)
       2.4  SOD，MDA的测定 
       
       取脑，肝脏匀浆上清液进行SOD，MDA的测定。结果表明，D-半乳糖模型组脑内SOD活力显著降低，MDA含量显著升高，开心散高、中剂量均能显著升高衰老小鼠脑，肝脏的SOD活力，开心散高，中，低3个剂量都能够显著降低小鼠脑的MDA含量，而开心散的中，高剂量可以显著降低肝脏MDA的含量。结果见表3～4。表3  开心散对D-半乳糖模型小鼠脑组织SOD活力和MDA含量的影响(略)
       表4  开心散对D-半乳糖模型小鼠肝脏SOD活力和MDA含量的影响(略)
       3  讨论
       生物大分子如蛋白质、脂质、核酸均可以在没有酶参与的条件下自发的与一些还原糖反应生成稳定的共价加成产物-高级糖基化终末产物，该反应过程称为非酶糖基化反应（NEG）。AGEs在组织中形成和沉淀后，引起组织的老化和功能衰退。自由基可以诱发细胞膜或细胞器中不饱和脂肪酸发生过氧化作用，也是生物学衰老的重要原因之一。近年来的研究表明,非酶糖基化和自由基相互促进，对衰老的发生发展起着协同作用，非酶糖基化反应可以通过多种途径促进自由基介导的过氧化反应，如修饰SOD等抗过氧化酶，直接产生过氧化阴离子，诱导形成AGE依赖的过氧化物来源，从而加重对机体的损伤［4］；另一方面，Wolff等发现氧自由基在非酶糖基化的初始阶段即已产生，因此认为，非酶糖基化反应是开始于还原糖的自身氧化，即还原糖先经氧化作用生成烯二醇和二羰基并产生超氧阴离子、过氧化氢和羟自由基，二羰基再与游离氨基发生反应并形成AGEs［5］。同时氧化作用促使非酶糖基化反应向晚期反应发展，对AGEs的形成起到了固定的作用，是造成蛋白质发生不可逆损伤的决定因素。
       本实验证实，开心散可以显著改善D-半乳糖模型小鼠的学习记忆能力，降低小鼠脑和肝脏的AGEs含量，提高小鼠脑和肝脏的SOD活性，降低MDA水平，表明开心散具有抑制高级糖基化终末产物的生成，清除自由基的作用。本文结果提示开心散可能通过清除AGEs含量、抗氧化等的作用来发挥其益智和抗衰老的作用。
       【参考文献】
         　　［1］Xu Song, Mingmin Bao, Diandong Li, et al. Advanced glycation in D-galactose induced mouse aging model［J］.Mechanisms of Ageing and Development, 1999,108: 239.
       
       ［2］余资江，应大君，董世武，等. 半乳糖急性致衰老动物模型剂量的探讨［J］.解剖学杂志, 2005,28(4): 42.
       
       ［3］孙贺英，张宗玉. 小鼠增龄过程中皮肤、尾腱非酶促糖基化的变化［J］.中国老年学杂志,1997,17（2）: 106.
       
       ［4］宋旭，包明敏. 非酶糖基化致衰老的实验研究［J］.中华老年医学杂志，1999,18(3)：164.
       
       ［5］陶凯中. 非酶糖基化和氧化作用与糖尿病血管重建［J］.国外医学·内分泌学分册，1999，19(4)：145.