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       【摘要】 
       目的通过观察云芝多糖（CVP）对CCl4肝损伤抗氧化酶、自由基及NO含量的变化，探讨CVP抗肝损伤的作用机制。方法4月龄昆明种小鼠50只，分正常对照组、病理造模组、CVP保护组分高、中、低3组，常规饲料，自由饮水。CVP组每天按50，100，200 mg/kg体重的云芝多糖灌胃1次，饲养8 d，末次灌胃2 h，正常对照组腹腔注射调和油溶液，其余各组腹腔注射0.15%CCl4调和油溶液(10 ml/kg体重)，12 h后禁食不禁水，18 h后处死小鼠，取出肝脏称重计算肝体指数；制备10%的肝匀浆，测定SOD，GSH-Px，NOS的活性和MDA，GSH，NO的含量。结果与模型组比较，CVP可降低肝体指数（P﹤0.05）和MDA的含量（P﹤0.001），提高抗氧化酶的活性和GSH含量（P﹤0.01），降低NOS活性和NO的含量（P﹤0.01）。结论 CVP可减轻肝损伤所致炎性反应，提高抗氧化酶的活性和GSH的含量，加速自由基的清除，降低NO的量，对实验性肝损伤有保护作用。
       【关键词】  肝损伤 四氯化碳 自由基 一氧化氮
       Effect of Coriolus versciclor Polysaccharides on the Content of Antioxidase, Free Radicals and NO in Liver Injury
       SUN Shezong, LU Juan, GUAN Shoutao, ZHAO Jie, ZHANG Hongmei
       (Yunyang Medical College,Shiyan 442000，China)
       Abstract：ObjectiveTo study the protective effect of Coriolus versciclor polysaccharides on CCl4-induced liver injury in rats through observing the contents of antioxidase, free radicals and NO. MethodsFifty Kunming mice of 4 months old were divided into control group, model group, groups treated with small, middle and large dose of CVP. Gastric perfusion was done with 50 mg/kg, 100 mg/kg and 200 mg/kg respectively everyday. Rats were given regular diet, free water for 8 days. 2 hours after the last gastric perfusion, mixed-edible-oil solution was injected for control group through belly cavity, other groups were treated with 0.15% CCl4 mixed with mixed-edible-oil(10 ml/kg). After 12 hours rats were absoluted diet and after 18 hours rats were sacrificed. The liver was taken out and weighed and the liver body index was calculated. 10% liver homogenate was prepared for test of the levels of SOD, GSH-Px, NOS, MDA, GSH and NO. ResultsCompared with model group, the liver body indexes of treatment groups were lowered(P<0.05), MDA content was decreased (P<0.01), antioxidase activity and GSH content were increased（P﹤0.01）, and NOS activity and NO content were decreased（P﹤0.01）. ConclusionCVP can eliminate inflammatory reaction of liver injury, increase antioxidase avtivity and GSH content, scavenge free radicals, decrease NO content, and protect from liver damage.
       Key words：Liver injury;  CCl4;  Free radicals;  NO
       一氧化氮（nitric oxide，NO）在肝细胞损伤中的作用已受到普遍关注，国内外研究表明NO对肝细胞既有保护作用又有细胞毒性和促进炎症的双重作用［1］。云芝多糖（Coriolus versciclor polysaccharides, CVP）具有增强免疫功能及较强的抗氧化作用［2～3］,但云芝多糖对实验性肝损伤自由基及NO含量变化的报道极少，各种原因的肝损伤与自由基和NO的含量变化密切相关［4］，本实验旨在用四氯化碳（CCl4）制备肝损伤模型，观察云芝多糖对实验性肝损伤所致抗氧化酶、自由基和NO含量的影响，以探讨云芝多糖抗肝损伤的作用机制。
       1  器材与方法
       1.1  动物、药品及试剂
       4月龄昆明种小鼠50只，由本院动物中心提供。丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD），谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、谷胱甘肽（GSH）、一氧化氮（NO）、一氧化碳合酶（NOS）检测试剂盒，购自南京建成生物工程研究所，云芝多糖购自神华药业有限公司，其余为国产分析纯生化试剂。
       1.2  仪器
       ZS83-1型内切式组织匀浆机（浙西机械厂），MDF-382E型超低温冰箱（日本Sony公司），722S型分光光度计（上海第二光学仪器厂），RA-50半自动生化分析仪（美国Technicon公司）。
       1.3 方法
       
       50只小鼠随机分为5组，每组10只，分正常对照组：常规饲料，饮自来水；病理造模组：常规饲料，饮自来水；云芝多糖保护组分高、中、低3组，常规饲料，自由饮水，按50，100，200 mg/kg体重云芝多糖灌胃，1次/d；饲养8 d，末次灌胃2 h，正常对组腹腔注射调和油溶液，其余各组腹腔注射0.15%CCl4调和油溶液(10 ml/kg体重)，12 h后禁食不禁水，18 h后处死小鼠，取出肝脏置冰生理盐水中洗净血液，用滤纸吸去水分称重计算肝体指数；然后用pH 7.4的PBS按1∶10稀释冰浴下制备10%的匀浆，4 000 r/min离心5 min，取上清液用双缩脲法测肝匀浆中蛋白质含量，按试剂盒要求测MDA，GSH-Px，GSH，SOD，NOS，NO的含量。
       1.4  统计学处理 
       所得数据用SPSS 10.0软件进行方差分析，以P=0.05为检验标准。
       2  结果
       2.1  不同浓度云芝多糖对实验性肝损伤小鼠肝体指数和MDA含量的影响模型组肝体指数明显大于对照组（P﹤0.05），说明CCl4损伤模型组肝脏出现炎性病变，肝细胞肿大，肝体指数增加；不同浓度的CVP对CCl4肝损伤有保护作用，肝体指数降低与模型组比较（P﹤0.05）。病理模型组MDA明显升高，不同浓度的CVP均可降低MDA的含量，与模型组比较（P﹤0.001）。结果见表1。表1  不同浓度云芝多糖对实验性肝损伤小鼠肝体指数和MDA含量的比较 (略)
       2.2  不同浓度云芝多糖对实验性肝损伤小鼠SOD，GSH-Px活性和GSH含量的影响SOD和GSH-Px是生物体内清除自由基最重要的抗氧化酶，GSH是重要的还原当量，可有效地参与清除自由基，不同浓度的CVP可提高实验性肝损伤小鼠SOD，GSH-Px的活性和GSH的含量，且存在效-量关系，与模型组比较（P﹤0.05或P﹤0.01）。结果见表2。表2  云芝多糖对实验性肝损伤小鼠SOD，GSH-Px活性和GSH含量的比较(略)
       2.3   云芝多糖对实验性肝损伤小鼠NO的含量和NOS活性的影响CCl4肝损伤模型小鼠肝细胞NOS活性和NO的含量与对照组比较明显升高，云芝多糖能够降低实验性肝损伤小鼠肝细胞中NOS的活性和NO的含量，不同浓度的CVP保护组对NOS的活性和NO的含量存在效-量关系（P﹤0.05或P﹤0.01）。结果见表3。表3  云芝多糖对实验性肝损伤小鼠NO的含量和NOS活性的比较(略)
       3  讨论
       CCl4所致实验性肝损伤，其机制主要是通过脂质过氧化作用引起肝损伤。CCl4进入机体后由肝微粒体细胞色素P450代谢，生成三氯甲基自由基（·CCl3）、氯离子自由基（·Cl）攻击肝细胞膜上磷脂分子引起脂质过氧化，导致脂质过氧化产物丙二醛（MDA）升高；此外，在·CCl3启动的过氧化连锁反应中，尚可产生毒性更强的超氧阴离子（O2-·）和氢氧阴离子（OH·）自由基，无选择性地损伤肝细胞的各个组分，首先引起膜性损伤，严重时可导致肝细胞变性坏死［5］。本研究表明，CCl4所致化学性肝损伤，通过脂质过氧化作用产生过量的自由基广泛损伤肝细胞，导致模型组小鼠MDA，NOS，NO显著升高，SOD，GSH-Px活性降低，GSH含量减少。CCl4所致急性肝损伤时引起炎性病变，导致模型组肝细胞肿胀，肝体指数增大，CVP可对抗和减轻肝细胞炎性病变的发生，CVP保护组肝体指数明显减小与模型组比较有统计学意义（P﹤0.05）；脂质过氧化代谢的终产物MDA，可直接激活Kupffer细胞，使之分泌细胞因子，再激活肝星状细胞进一步损伤肝细胞，所以MDA含量可反映自由基对肝细胞损伤程度，不同浓度的CVP保护组可降低MDA的含量（P﹤0.001）。
         
       SOD，GSH-Px是体内重要的抗氧化酶，当体内代谢过程中产生自由基时，SOD可与其反应产生H2O2，H2O2与GSH在GSH-Px催化下生成水，从而使自由基清除［6］。CCl4进入机体后由肝微粒体细胞色素P450代谢，生成三氯甲基自由基（·CCl3），在·CCl3启动的过氧化连锁反应中，尚可产生毒性更强的超氧阴离子（O2ˉ·）和氢氧阴离子（OH·）自由基，从而使SOD，GSH-Px和GSH的消耗增加，故导致模型组SOD，GSH-Px活性和GSH含量明显降低。CVP是一种糖蛋白其增加抗氧化酶活性的机制，可能是作为反式作用因子诱导SOD，GSH-Px的合成，不同浓度的云芝多糖保护组可增加SOD，GSH-Px活性和GSH含量，对CCl4肝损伤有保护作用。
       
       NO是L-精氨酸（L-Arg）在一氧化氮合酶（NOS）催化下生成的。NOS有两种类型，即结构型NOS合酶（cNOS）和诱导型NOS合酶（iNOS），后者主要分布在肝细胞和Kupffer细胞及肝内皮细胞，可被内毒素和多种细胞因子诱导活化，产生大量的NO［7］。CCl4肝损伤时模型组NOS活性和NO含量升高，可能原因是CCl4肝损伤时产生的TNF，IL-1等细胞因子作用于肝细胞，导致诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的基因表达，促进NO的合成。临床资料表明婴儿肝炎患者血清NO的含量明显高于正常对照组，NO的含量与病情成正比［8］。NO对肝细胞具有双重作用，既有保护功能又有杀伤毒性与促进炎症的作用，生理浓度的NO对肝脏有保护作用，NO一方面能和羟自由基（·OH）反应，生成HONO而减轻羟自由基对组织的损伤。另一方面高浓度的NO可抑制肝细胞蛋白质的合成和损伤DNA结构，直接抑制线粒体呼吸，使肝细胞内能量代谢障碍而引起肝细胞凋亡和坏死，高NO与氧自由基反应生成超氧化亚硝基阴离子（ONOO－），后者是蛋白和非蛋白巯基的强氧化剂，比NO的作用强50～1 000倍，攻击肝星状细胞（HSC）引发脂质过氧化连锁反应，因此NO对自由基（O2-·）损伤作用起放大效应，是氧化应激损伤的最主要自由基之一［4］。CVP能降低NOS活性及NO的含量（P﹤0.05或P﹤0.01），说明CVP可通过降低NO的含量对肝损伤起保护作用。
       
       总之，CVP可减轻实验性肝损伤所致炎性反应，降低肝体指数，提高SOD，GSH-Px的活性和GSH的含量，加速清除自由基降低MDA的含量，降低NOS的基因表达和NO的含量，对实验性肝损伤起保护作用。
       【参考文献】
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