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       【摘要】 
       目的优化葛根总黄酮提取工艺。方法采用水提壳聚糖澄清法与传统水提醇沉法平行对比，正交实验考察解吸剂（乙醇）浓度、解吸温度、洗脱速度3个因素，以总黄酮提取量、葛根素提取量、得膏率为考察指标综合评价。结果壳聚糖澄清工艺能有效保留葛根中葛根素及总黄酮等有效成分，节省乙醇用量，缩短生产周期。选取最佳纯化条件：乙醇浓度为70%，洗脱温度35℃，洗脱速度为2BV/h。采用该工艺葛根总黄酮纯度达60%以上。结论该法简单可取，适合于工业化大生产。
       【关键词】  葛根总黄酮 葛根素 提取 大孔树脂
       Research of the Preparation Process of the Total Flavones in Radix Puerariae by the Method of Water Extraction-Chistosan Clarification-Adsorption Separation through Macroporous Resin
       ZHANG Tong, ZHENG Caimei, TAO Jiansheng, DING Yue，SHEN Tingting
       （Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203 China）
       Abstract：ObjectiveTo optimize the extraction technology of the total flavones in Radix Puerariae. MethodsContrast the methods of clarifying water extractive solution of Radix Puerariae by chitosan and by alcohol. The orthogonal design method was adopted to study the effect of three factors including the concentration of the alcohol, the temperature and the speed of desorption. Extraction rate of total flavones and puerarin, the yielding rate of extractive were regarded as indexes.ResultsThe clarifying process of chitosan could remain the effective contents such as the total flavones and puerarin. It not only saved the volume of alcohol, but also cut down the period of production. The optimum separation conditions were the elute solution of 70% alcohol, the speed of 2 drops per second and the temperature of 35℃. The yield of total flavones from Radix Puerariae by the purity reached above 60%. ConclusionThe process is simple and preferable, which adapts to industrial production.
       Key words：Total flavones in Radix Puerariae;   Puerarin;   Extraction;   Macroporousresin
       
       葛根为常用中药，始载于《神农本草经》，性味甘、辛、凉,归脾、胃经。具有解肌退热、生津、透疹和升阳止泻等功效。用于外感发热头痛、项背强痛、心绞痛、高血压病、口渴、麻疹不透、热痢等。已知葛根中所含的主要成分为异黄酮：葛根素、大豆苷、大豆苷元等。本工艺采用的水提-壳聚糖澄清-大孔树脂纯化制备葛根总黄酮，以期为工业化大生产提供参考。
       1  仪器与试药
           
       美国惠普UV-8453紫外-可见分光光度计；Agilent 1100液相色谱仪；Sartorius Cp225D型电子天平；上海申生RE-52AA型旋转蒸发器；DZF-6050型真空干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；LXJ-IIB低速大容量多管离心机（上海安亭科学仪器厂）；HHS型电热恒温水浴锅（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）。AB-8大孔树脂（天津南开大学树脂厂生产）；葛根饮片（批号：061216，上海康桥中药饮片有限公司）；葛根素对照品（批号：110752-200209，中国药品生物制品检定所）；壳聚糖、乙醇、甲醇为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）。
       2   方法与结果
       2.1  大孔吸附树脂预处理取大孔吸附树脂，用乙醇加热回流洗脱，至洗脱液蒸干后无残留物，经乙醇洗净的树脂挥去溶剂后保存备用。
       2.2   含量测定用紫外-可见分光光度法测定葛根总黄酮的含量［1］。用高效液相色谱法测定总黄酮中葛根素的含量［2］。
       2.3   葛根总黄酮的提取取葛根饮片20 g，置800 ml烧杯中，加200 ml水，浸泡30 min ，煮沸1 h ，纱布滤过，药渣用160 ml水再煮沸30 min ，纱布滤过，合并两次的滤液，浓缩至6 ml/g生药。
       2.4   葛根总黄酮的纯化
       2.4.1   初步纯化工艺选择水提壳聚糖澄清工艺：水煎液浓缩至浓度为6 ml/g生药时，取50 ml的浓缩液 3 份，每份加10%～15%体积的1%壳聚糖溶液沉淀，静置一夜，1 500 r/min 离心30 min ，弃去沉淀，上清液进行含量及得膏率测定。
        
       水提醇沉工艺：水煎液浓缩至浓度为1 ml/g生药时，以95%乙醇醇沉至含醇量70%。1500 r/min离心30 min，弃去沉淀，上清液进行含量测定及得膏率测定。
       
       浸膏得率测定：分别取上述两种提取方法的供试品适量，转移到100 ml蒸发皿中，水浴蒸发，近干后置烘箱内105℃干燥2 h，取出置干燥器内冷却30 min，称重。再以105℃干燥2 h，冷却，至恒重。结果见表1。表1  澄清工艺与醇沉工艺比较（略）
       结果表明，与醇沉工艺相比，壳聚糖澄清工艺能有效保留葛根中葛根素及总黄酮等有效成分，能节省乙醇用量，缩短生产周期。壳聚糖澄清剂能以电中和及吸附架桥的方式去除水提液中各种悬浮颗粒及蛋白质、鞣质、果胶等大分子物质，达到分离纯化的目的。但单独应用得膏率仍偏高，一般可作为初步精制方法。与其它方法联用，分离纯化效果较好。
       2.4.2  大孔树脂纯化条件优化［3］在大孔树脂洗脱过程中，解吸剂乙醇浓度、解吸温度、洗脱速度对纯化过程影响较大。故采用正交实验以进一步优化洗脱工艺条件。按L9（34）正交表进行实验，因素水平表见表2。结果见表3～4。表2  正交实验因素水平（略）表3  正交实验设计（略） 表4  正交实验方差分析（略）
       直观分析表明，以综合评分为标准，在所选因素水平范围内，解吸剂洗脱时的温度对洗脱效果影响较大，其次为洗脱速度，而乙醇浓度影响较小。方差分析表明，因素B（解吸剂洗脱时的温度）为显著性影响因素，因素A和C则影响不显著。故选取最佳提取条件为A2B2C3，即70%乙醇、35℃洗脱，洗脱速度为2.0BV/h。洗脱速度与层析柱的大小有关，需要根据实际情况进行调整。
       2.5   优选工艺验证实验根据以上优化的提取纯化工艺条件，制备5批次总黄酮提取物。结果见表5。表5  不同批次葛根总黄酮提取物的含量测定结果（略）
       验证结果表明，葛根总黄酮提取物质量稳定，所选择工艺合理、可行。
       2.6  大孔树脂吸附葛根总黄酮的使用次数和再生次数考察当树脂使用一定时间和次数以后，树脂就会受到污染导致吸附能力降低，此时必须经过再生处理后才能继续使用。AB-8树脂再生的方法同上文所述的AB-8树脂预处理的方法。参考厂家说明书，AB-8大孔树脂使用后，以95%乙醇洗柱，至流出液加入等量水不显浑浊，再以去离子水洗柱，至流出液无乙醇味，可继续使用。当树脂吸附量下降30%时，树脂应进行再生。考察结果见表6。表6  AB-8大孔树脂精制葛根总黄酮的使用次数和再生次数考察结果（略）
       结果显示，AB-8大孔树脂使用30次后仍然保持葛根总黄酮吸附量为初始的90%以上。
       3  讨论
           
       微波助提葛根总黄酮［4］，提取效率很高，但微波提取工业化的设备还处于研发阶段，尚未得到广泛推广应用。本实验以水煎提取葛根总黄酮，其提取率与30%，90%乙醇提取效果相似，故拟以水为提取溶剂，降低成本，提高生产安全性。
        
       AB-8大孔树脂精制葛根总黄酮，树脂可反复使用。这可能与壳聚糖澄清剂能有效除去葛根水提液中的胶质、蛋白质、鞣质有关，从而延长了树脂使用寿命。
        
       因此，水提-壳聚糖澄清-大孔树脂纯化制备葛根总黄酮，降低了生产成本，极大地提高了经济效益，有利于工业化大生产。此法得到的葛根总黄酮纯度达60%以上，为进行基于中药有效部位的新药开发提供了参考。
       【参考文献】
         　　［1］刘逢芹,刘田云,李贵海,等.分光光度法和HPLC法测定野葛藤总黄酮及葛根素含量［J］.中药材,2005,28（10）:895.
       
       ［2］国家药典委员会.中国药典,Ⅰ部［S］.北京：化学化工出版社,2005:233.
       
       ［3］桂 本,郭 嘉,池汝安,等.大孔吸附树脂对葛根总黄酮吸附性能的研究［J］.应用化工,2007,36（5）：451.
       
       ［4］白兰莉,蒋柏泉,黄庆荣,等.葛根总黄酮提取新工艺的研究［J］.南昌大学学报·工科版,2006,28（3）：227.