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       【摘要】 
       目的利用PCR技术鉴定干燥蛇粗毒的来源物种，并对基因组DNA的提取效果及提取过程中需注意的若干问题进行分析和讨论，同时还对若干针对不同长度目的基因扩增引物的使用效果进行验证。方法从1份已保存了7年的生产用干燥蛇粗毒中提取总DNA，并以之为模板进行PCR扩增、测序和序列分析。结果使用该方法可从蛇粗毒中提取得到微量的总DNA，并成功扩增得到0.45～1.18 kb不同长度范围的目的片段；测序结果提交NCBI，并与GenBank中的同源序列进行BLAST比对。结论该蛇粗毒样品来自眼镜蛇，且极可能由多个不同的亚种或单倍型所组成。该技术有可能推广用于对动物粗毒的来源进行准确和直接地鉴定。
       【关键词】  蛇粗毒；分子鉴定；线粒体基因； DNA测序
       DNA Molecular Identification of One Snake Crude Venom Used for Production
       CHEN Nian, ZHAO Shujin, HAN Liping
       （1.Department of Bioscience and Engineering, South China University of Sciences and Technology, Guangzhou 510640, China； 2.Department of Pharmacology, General Hospital of Guangzhou Military Command, Guangzhou 510010, China）
       Abstract：ObjectiveTo identify dried snake venom by PCR. MethodsTo extract DNA and subsequent sequencing of the mitochondrial genes from a snake venom that had been preserved for nearly 7 years.ResultsMinimal genomic DNA could be extracted from the crude venom by this method, and from which different length of target regions that ranged within 0.45～1.18 kb were amplified successfully. All the sequences were submitted to NCBI and compared against their homologous sequences in the GenBank database. ConclusionSequence alignment analyses approved that Naja naja was its most probable original specie, and this sample could be consisted by some different subspecies or haplotypes. This approach offers a straight forward method for direct and accurate identification of animal crude venoms.
       Key words：Snake crude venom；  Molecular identification；  Mitochondrial gene；  DNA sequencing
       
       近年来，有关中药中毒病例的报道为数不少，如中药性肾损害、中药致癌等问题已引起了国内外学者的高度关注。目前，已发现有包括蛇毒（其它如斑蝥、鱼胆、海马和蜈蚣等）在内的近十几种动物类中药均可致肾脏损害［1］。研究发现，导致此类损害的主要原因可分为中药内在属性不明确以及用药方式不恰当两方面。其中决定中药内在属性最基本的因素——即动、植物种属分类，则时常为研究者所忽略，由此带来的后果，如物种命名不规范等，均可导致药品质量不稳定以及毒副作用发生变化等诸多不良后果。以含蛇粗毒类成分的中药为例，研究者在制剂过程当中对药用原料的来源物种进行准确地鉴定是非常必要的，是决定用药安全的首要环节。  
        
        为解决以上实际问题，本文成功从1份已保存了7年的生产用干燥蛇粗毒中提取总DNA并对其来源物种的身份进行了初步地鉴定，同时对可能影响到鉴定效果的一些因素进行了探讨。
       1  器材
       1.1  材料 
       生产用蛇粗毒由中国人民解放军广州军区广州总医院药学部提供（批号：001212），样品采集于200005，由广州市蛇毒研究所经生化鉴定为舟山眼镜蛇（Naja naja atra）粗毒。新鲜毒液经冷冻干燥处理后铝罐密封，置4 ℃长期储存。
       1.2  试剂与仪器
       DP 303离心柱型基因组提取试剂盒和DNA Marker III（天根生化科技有限公司），2×Taq PCR MasterMix（广州美津生物技术有限公司），PCR产物胶回收纯化试剂盒（北京艾科基因技术有限公司），蛋白酶K（Amresco公司），引物（北京赛百盛基因技术有限公司合成），dNTPs，PCR缓冲液，rTaq DNA聚合酶和DL 15 000 DNA分子量标记（宝生物工程大连有限公司）。PE-2400型PCR扩增仪（美国Perkin Elmers公司），3730-XL型96道毛细管基因分析仪（美国ABI公司），GDS-8000型凝胶成像系统（美国UVP公司）。
       2  方法与结果
       2.1  蛇粗毒中总DNA的提取 
       称取蛇粗毒冻干粉100 mg，缓慢倒入已加有3 ml超纯水的5 ml离心管中，漩涡振荡至完全溶解，室温静置几分钟后，以10 000×g离心5 min，弃上清液，管底可见少量白色沉淀，将沉淀用适当体积的超纯水重新悬浮，10 000×g离心1 min。沉淀中总DNA的提取按试剂盒提供的说明书进行并略作修改，主要步骤如下：加200 μl的缓冲液GA，用手指轻弹管底使沉淀悬浮，加10 μl 40 mg·ml-1蛋白酶K，56 ℃孵育30 min，加220 μl的缓冲液GB，60 ℃放置10 min，再加220 μl无水乙醇，将所有溶液加入吸附柱，依次用去蛋白液GD和漂洗液PW处理后，加60 μl预热的洗脱液进行洗脱。对于-70 ℃条件下冻存的肌肉组织，用同样的试剂盒提取总DNA，除洗脱液改为200 μl超纯水外，其余步骤完全按说明书进行。
       
       粗毒中提取的总DNA经1.0％琼脂糖凝胶电泳分析，在0.8～10 kb范围内呈弥散分布，颜色较深的区域位于2 kb左右（见图1，泳道2，上样量为30 μl）。
       2.2  扩增反应和测序PCR反应体系均为50 μl，内含不同浓度的模板DNA、0.6 μM各引物（见表1）、0.2 mM各dNTPs、1×PCR缓冲液和2 U的高保真Taq DNA聚合酶。2×Taq PCR MasterMix的使用完全按产品说明书进行。对于蛇粗毒样品，直接加入一定量的洗脱液作为模板，阳性对照为从蛇肌肉组织中提取的总DNA，不足部分以超纯水补足。扩增参数：94 ℃预变性3 min，共循环32～35次，依次为94 ℃变性30～60 s，55～60 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，最后在72 ℃延伸补齐5 min。取PCR产物5 μl用1.0％琼脂糖凝胶电泳进行检测。PCR产物纯化、克隆和测序委托广州拓谱基因技术有限公司完成。表1  线粒体基因扩增引物（略）
       2.3  洗脱方式和模板用量对扩增效果的影响
       2.3.1  洗脱方式的选择 
       如图2所示，泳道1～3所用模板来自江西产舟山眼镜蛇肉（模板用量依次为150，60 ng和30 ng），泳道4、5所用模板来自蛇粗毒（模板用量为35 μl，洗脱液类型分别为超纯水和TE）。所有样品均扩增出约0.45 kb的目的条带，随着模板用量的减少，扩增产物的亮度不断减弱，不考虑蛇毒来源的基因组DNA模板中可能存在的对PCR反应起抑制作用的成分，可粗略估算出从蛇粗毒中提取的基因组DNA浓度约为1 ng/μl。泳道4比泳道5略暗，这说明洗脱液类型对扩增效果的确存在一定程度的影响。研究者可根据离心后管底收集的白色细胞沉淀量的多少自行调整洗脱液的类型和用量。本实验中洗脱液用量均采用60 μl。
       2.3.2  最低模板用量 
       美津公司MasterMix（泳道1，模板用量12.5 μl）和TakaRa公司高保真Taq扩增体系（泳道2～4，模板用量依次为12.5，6.25 μl和3.125 μl）均扩增得到约0.45 kb的目的条带（见图3），随着模板用量减少，扩增产物亮度不断减弱，当模板用量低至3.125 μl时仍可见较弱的目的条带。当样本量较大时，选用预混的PCR反应体系可显著提高分析效率及降低单个检测反应的成本。对多种不同类型蛇粗毒分析的经验表明，从粗毒用量、试剂盒类型和洗脱液用量3个方面考虑，以采用硅基质材料的柱式基因组提取试剂盒提取100 mg的干燥蛇粗毒冻干粉为例，当洗脱液用量为60 μl时，仅需取5 μl洗脱液作为模板即可得到比较稳定的扩增效果。
       2.4  不同长度目的基因的扩增效果 
       表1中的引物均可很好地扩增以眼镜蛇为代表的常见毒蛇类物种。如图4所示，泳道2所用模板来自江西产舟山眼镜蛇肉（扩增引物为16H1/16L1），泳道3～8所用模板来自蛇粗毒（模板用量为5 μl，扩增引物依次为16H1/16L1，tRNATrpR/L4437b，H16064/L14910，H43/L13，Leu/ND4和PPhe/PVal），以上所有样品均扩增得到单一目的条带。虽然从条带亮度上判断，个别PCR产物的浓度较低（图4，泳道3），但通过优化热循环反应参数（例如将循环数增加到35～40），此类问题一般可得到有效地解决。在利用DNA序列分析进行物种鉴定的研究中，不同类型或长度的目的基因所含有的遗传信息在性质和数量上均存在差异，且对于质量较低的模板，片段越长，扩增的成功率也越低，因此，预先对各种不同类型引物的扩增和鉴定效果进行筛选是很必要的。
       2.5  序列提交和分析  
       2.5.1  序列提交 
       结果提交GenBank，利用BLAST检索初步推测其身份。同时用BioEdit v 7.0.5.3［2］软件进行多重序列比对，并结合测序峰图进行分析。
       2.5.2  BLAST检索 
       将图2中泳道4，5的样品进行PCR产物直接测序（GenBank登录号为EF413642和EU181149），泳道4的样品同时进行TA克隆测序，随机挑取两个克隆进行测序的结果完全一致（EU181148）。BLAST检索结果发现，与直测和克隆测序结果相似性百分数最高的序列均来自眼镜蛇线粒体16S rRNA基因——Naja naja（眼镜蛇，Z46482.1）和Naja naja naja（眼镜蛇指明亚种，L10674.1）。Z46482.1与直测结果相似性百分数依次为89％和90％，L10674.1为86％和88％；Z46482.1与克隆测序的相似性百分数最高，达97％——上述结果初步证实该蛇粗毒样品来自眼镜蛇。
       2.5.3  序列同源比对和相似性分析 
       以江西产舟山眼镜蛇肉及其粗毒来源的同源序列作为参考（陈念等，in press），进一步利用BioEdit软件进行分析（见表2和图5）。结果发现：①EF413642和EU181149来源于同一批生产用蛇粗毒所提取的DNA，是两次独立的PCR反应产物直接测序所得，进行此项比较的目的主要是为了分析混合模板对直测结果稳定性的影响。虽然两者的测序峰图均存在较严重的套峰，但机读结果的一致性却非常好。对该现象可能的解释是：直测结果包含了潜在的多种不同模板来源的序列信息，但由于同一批蛇毒中各种不同来源的模板在比例上是一致的，这反映在测序峰图上即在各模板序列的同源位点上不同信号强度的比例也是一致的，因此仍然可得到稳定的机读测序结果。②两次克隆测序的结果完全一致（EU181148），且从峰图上看测序效果非常好。出乎意料的是，克隆与直测结果间存在显著的差异，且明显属于两种不同的来源，前者与江西产舟山眼镜蛇及其粗毒具较高的同源性。结合①来看，该样品的确由多种不同来源的模板所组成，并且可能混有江西来源的舟山眼镜蛇粗毒，但具体含有多少种不同来源的模板类型还有待于挑取更多的克隆进行测序才能确定。③江西产舟山眼镜蛇肉及其粗毒来源的序列同源性很高（EF413644和EF413645），两者均为直接测序所得，仅在个别位点上存在差异，这说明该粗毒样品的模板来源比较单一。表2  部分16S rRNA基因序列相似性矩阵（略）
       3  讨论
        一直以来，由于人们对蛇类物种起源、地理分布及其分类和命名等方面的认识还并不十分完善，使得蛇毒及其相关领域的研究者往往忽略了对其来源物种进行准确鉴定的重要性［3］。一方面，蛇毒组成极其复杂，且存在显著的种间和种内变异［4］；另一方面，从当前含蛇粗毒类成分中药制剂研究的实际出发考虑，研究者多通过某些渠道间接获得蛇毒样品，而那些以提取和销售蛇毒为目的的供应蛇毒的机构大多为私有，且缺少与大学等科研机构的合作［5］；更严重的问题是，当前即使是正规的蛇毒检验机构所出具的检验报告，也往往是根据蛋白电泳图谱或样品提供者自身的描述，就粗略地对其来源物种的身份进行判断。
       
       因此，在目前来说，研究者如能掌握此项技术，并自行对蛇毒来源有关的信息进行核实是非常必要的，如对物种进行准确地鉴定以及了解其来源的地理位置等［6］。
        本文成功从1份已保存了7年的生产用干燥蛇粗毒中提取总DNA并对其来源物种的身份进行了初步地鉴定，但还需进一步对以下问题进行研究：①在对混合模板来源的PCR产物进行直接测序时，测序峰图中常存在大量的套峰，并对测序结果的解读造成影响；②若进行克隆测序，常由于克隆数目的限制而使得鉴定结果无法充分反应模板来源的实际情况。
        虽然利用DNA测序和BLAST检索只能对物种的分类地位进行粗略地鉴定，但上述分析的结果表明，此方法用于快速鉴定蛇粗毒可能的来源物种是非常有效的。有关该方法的适用范围以及如何将该技术在实践中获得推广，笔者将另文进行详细地探讨。
        致谢：感谢广州军区广州总医院医学实验科在实验上给予的帮助！
       【参考文献】
         　　［1］张玉梅,孙桂芝,周 同.中药与肾毒性［J］.中华实用医药杂志,2003,3(14):108.
       
       ［2］Hall TA. Bioedit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT［D］.Nucleic Acids Symposium Series. London: Oxford University Press,1999：95.
       
       ［3］McLane MA,Sanchez EE,Wong A,et al. Disintegrins［J］.Curr Drug Targets Cardiovasc Haematol Disorders,2004,4(4):327.
       
       ［4］Fry BG,Winkel KD,Wickramaratna JC,et al. Effectiveness of snake antivenom: species and regional venom variation and its clinical impact［J］.J Toxicol Toxin Rev,2003,22(1):23.
       
       ［5］Powell RL,Sanchez EE,Perez JC. Farming for venom:survey of snake venom extraction facilities world wide［J］. Appl Herpetol,2006,3(1):1.
       
       ［6］Wuster W,Golay P,Warrell DA. Synopsis of recent developments in venomous snake systematics［J］. Toxicon,1997,35(3):319.