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       【摘要】 
       目的研究不同制备方法对西黄丸体外抑瘤作用的影响。方法采用3种制备方法，即西黄丸浸提液、煎液、含药血清，MTT法分别测定其对两种人恶性肿瘤细胞株（人原发性肝癌细胞株SMMC7721、人早幼粒细胞白血病细胞株HL－60）增殖的影响。结果西黄丸浸提液和煎液均表现出明显的抑瘤作用(P<0.05，P<0.01)，且抑瘤效应以浸提液为佳(P<0.05)；西黄丸含药血清未表现出抑瘤效应，且含药血清在较高浓度时，对细胞生长表现出促进作用(P<0.01)，与空白大鼠血清作用相似。结论不同的制备方法对西黄丸体外抑瘤作用有明显的影响，西黄丸浸提液和煎液均具有明显的抑瘤作用，且浸提液的抑瘤作用优于煎液，古人将西黄丸定位于丸剂，确有其合理性和科学性。血清药理学实验方法是否适合于体外抑瘤实验需进一步探讨。
       【关键词】  西黄丸； 制备方法； 抑瘤作用； 血清药理学； 体外实验
       Comparative Study of Antitumous Effects of Xi Huang Pellet by Different Processing Methods
       JIN Shenrui, ZHU Bide, QIN Xuhua, QU Yan
       (College of Preclinical Medicine, Chengdu University of TCM, Chengdu 610075, China)
       Abstract：ObjectiveTo compare antitumous effects of Xi Huang pellet by different processing methods.MethodsLeachate, decoction and blood serum of Xi Huang pellet were used to treat diverse human malignant tumor cell strains（SMMC7721, HL-60）in vitro, proliferations of cells were determined by MTT assay. ResultsThe leachate and decoction of Xi Huang pellet showed obvious inhibitory effects on cell multiplication of human malignant tumor cell strains (P<0.01；P<0.05)，and inhibitory effect of leachate was stronger than that of decoction. Blood serum of Xi Huang pellet showed no inhibitory effect, on the contrary, blood serum of Xi Huang pellet could promote cell multiplication just like blood serum of control.ConclusionAntitumous effects of Xi Huang pellet by diverse methods are different. Leachate and decoction of Xi Huang pellet showed obvious antitumous effects in vitro,and leachate of Xi Huang pellet is stronger than that of decoction.
       Key words：Xi Huang pellet；  Processing method；  Antitumous effect；  Blood-serum pharmacology；  Experiment in vitro
       
       西黄丸为中药抗癌名方，功效为活血化瘀、清热解毒、消肿止痛。目前国内有临床文献报道，西黄丸可用于乳腺癌、肝癌、白血病等多种恶性肿瘤的治疗，并取得了较好的疗效［1，2］。西黄丸为中药复方丸剂，如何开展传统复方的现代体外实验研究，采用何种制备方法，不同的制备方法是否会明显地影响药效，这是中药复方体外研究必须面对的问题。为此，结合前人研究经验，我们选择了3种制备方法，即：西黄丸浸提液、西黄丸煎液、西黄丸含药血清，并通过MTT法对它们的体外抑瘤效应进行了比较。
       1  材料与仪器
       1.1  药物西黄丸，九寨沟天然药物集团有限公司生产，批号：030501。
       1.2  西黄丸浸提液、煎液、含药血清制备方法
       1.2.1  西黄丸浸提液采用密闭容器，以预冷4℃的RPMI-1640培养液浸泡西黄丸24 h（比例为0.1 g/ml），超声振荡助溶2 h，复以4℃下继续浸泡48 h后取上清液，用0.22 μm微孔滤器过滤后，得到西黄丸浸提液。实验时用RPMI-1640培养液稀释至所需浓度使用。
       1.2.2  西黄丸煎液采用密闭容器，以预冷4℃的RPMI-1640培养液浸泡西黄丸24 h（比例为0.1 g/ml），超声振荡助溶2 h后，取有冷凝回流装置的三角烧瓶加热至沸腾20 min，复以4℃下继续浸泡48 h后取上清液，0.22 μm微孔滤器过滤后，得到西黄丸煎液。实验时用RPMI-1640培养液稀释至所需浓度使用。
       1.2.3  西黄丸含药血清根据文献［3］取SD大鼠9只，雄性，体重180～200 g,分为3组，每组3只，设西黄丸混悬液高剂量、低剂量、空白组，分别给予西黄丸混悬液高剂量（0.96 g/kg）、西黄丸混悬液低剂量（0.48 g/kg）（西黄丸每日人用量6 g,以50 kg为正常人体重计算，动物给药量相当于人用量18，9倍），空白组予等体积蒸馏水，每日1次灌胃给药；连续7 d，末次给药2 h后，通过经一侧颈总动脉插管后采血，分离血清，56℃30 min灭活，0.22 μm微孔滤膜过滤，分装后，-72℃备用，使用时用RPMI-1640培养液稀释至所需浓度使用。
       1.3  试剂 DMSO 、MTT Sigma公司产品； 1640培养基Gibco公司产品；胰蛋白酶Serva公司产品；新生小牛血清，三利生物制品厂产品。
       1.4  动物SPF级SD大鼠，雄性，体重180～200 g，成都中医药大学实验动物中心提供，实验动物合格证号号：SCXK（川2004-12）。
       1.5  细胞株①人原发性肝癌细胞株SMMC7721；②人早幼粒细胞白血病细胞株HL－60细胞株，由本校病理教研室提供；均用含10%新生小牛血清的RPMI-1640培养基培养。
       1.6  仪器SANYO Labo Autoclave ML-3020 高压蒸气消毒机；Thermo Labsystems Multiskan MK3全自动酶标仪；HERA cell CO2 培养箱； Heal Force公司HFsafe-1200型生物安全柜；MILLEXGP 0.22μm微孔滤器，MILLIPORE公司。
       2  方法
       2.1  分组设空白对照组（含1640培养液、人肿瘤细胞）；药物处理组(含1640培养液、人肿瘤细胞和西黄丸浸提液或煎液，按等倍关系设5个浓度)。
       2.2  MTT实验方法取对数生长期的人原发性肝癌细胞株SMMC7721，0.25%胰蛋白酶消化，计数细胞，用1640培养基稀释成5×105/ml浓度的单细胞悬液，每孔100 μl，接种到96孔板上，置37 ℃,5%CO2，饱和湿度的细胞培养箱中，培养6h待细胞贴壁后，设空白对照组、药物处理组。空白对照组用等体积1640培养液代替受试药物，药物处理组加入不同浓度的药物（每个浓度设4复孔），每孔20 μl。96孔板置37 ℃,5%CO2，饱和湿度的细胞培养箱中，培养48h后，加入5 mg/ml MTT，每孔20 μl，培养4h，离心后弃上清液，加入DMSO，每孔150 μl，水平摇床振荡10 min，使结晶物充分溶解，酶标仪上测定其吸光度（A值），吸收波长为490 nm。同法检测西黄丸浸提液、煎液、含药血清对人早幼粒细胞白血病细胞株HL－60细胞株的影响（该细胞株为悬浮生长，故直接用对数生长期的HL-60细胞使用，未经胰酶消化步骤及细胞贴壁过程，其余步骤同前）。每种瘤株重复实验3次。
       2.3  统计学方法
       用《中国医学百科全书·医学统计学》统计软件包PEMS3.1进行。
       3  结果
       3.1  西黄丸浸提液、煎液、含药血清对人原发性肝癌细胞SMMC7721增殖的影响结果见表1～2。表1  西黄丸浸提液和煎液对人原发性肝癌细胞SMMC7721增殖（48 h）的影响（略)  表2  西黄丸含药血清对人原发性肝癌细胞SMMC7721增殖（48 h）的影响（略) 
       
       如表1所示，西黄丸浸提液与SMMC7721细胞作用48 h后，随浓度的上升，其抑制率上升，呈剂量依赖关系。西黄丸浸提液在100，200 μl /ml浓度时对SMMC7721细胞增殖有明显的抑制作用(P<0.01)；西黄丸煎液在100，200 μl /ml浓度时也表现明显的抑制作用(P<0.05)。浸提液与煎液比较发现，在100，200 μl /ml浓度时煎液抑制强度不如浸提液(P<0.05)。
        如表2所示，西黄丸高、低两个剂量组的含药血清与SMMC7721细胞作用48h后，各浓度组对SMMC7721细胞增殖未见明显的抑制作用；相反，含药血清在50，100，200 μl /ml浓度对SMMC7721细胞增殖有明显促进作用(P<0.05，P<0.01)，与空白对照血清作用十分相似。
       3.2  西黄丸浸提液、煎液、含药血清对人早幼粒细胞白血病细胞HL-60增殖的影响结果见表3～4。表3  西黄丸浸提液和煎液对人早幼粒细胞白血病细胞HL-60增殖（48 h）的影响（略) 表4  西黄丸含药血清对人早幼粒细胞白血病细胞HL-60增殖（48 h）的影响（略) 
       如表3所示，西黄丸浸提液与HL-60细胞作用48 h后，随浓度的上升，其抑制率上升，呈剂量依赖关系。西黄丸浸提液在100，200 μl /ml浓度时对HL-60细胞增殖有明显的抑制作用(P<0.05；P<0.01)。西黄丸煎液仅在200 μl /ml浓度时表现出对HL-60细胞增殖有明显的抑制作用(P<0.05)。浸提液与煎液比较发现，在200 μl/ml浓度时煎液抑制强度不如浸提液(P<0.05)。
        如表4所示，西黄丸高、低两个剂量组的含药血清与HL-60细胞作用48h后，各浓度时对HL-60细胞增殖未见明显的抑制作用；相反，含药血清在50，100，200 μl /ml浓度对HL-60细胞增殖有明显促进作用(P<0.05，P<0.01)，与空白对照血清作用十分相似。
       4  讨论
        药物的体外实验研究干扰因素少，结果重复性好，是抗癌药物研究中常用的方法。中药复方由于成分复杂，体外实验研究受到很多非特异性因素的干扰，如：制剂的pH、离子浓度、色素等，因此进行中药复方的体外研究存在较大的困难。西黄丸是复方丸剂，如何进行体外实验研究，不同的制备方法是否会明显影响药效，是本次研究的焦点。为此采用了3种制备方法，即：浸提液、煎液、含药血清进行了初步研究。结果显示，西黄丸浸提液和煎液均表现出明显的抑瘤作用(P<0.01或P<0.05)，且抑瘤效应以浸提液为佳（P<0.05)；西黄丸含药血清未表现出抑瘤效应，且在较高浓度时，对肿瘤细胞生长表现出促进作用(P<0.01)，与空白组大鼠血清作用相似。
       4.1  西黄丸低温浸提液抑瘤效应优于煎液通过对比浸提液与煎液抑瘤作用，证实不同的制备方法对西黄丸的抑瘤作用有明显的影响，低温浸提液的抑瘤效果明显高于煎液(P<0.05)。从西黄丸的组方看，麝香、乳香、没药中含有大量挥发性成分，尽管在煎液的制备过程中采用了冷凝回流装置防止挥发性成分散失，但从实验的结果来看，依然不能完全保证挥发性成分在加热过程中的丢失。当然，也不能排除加热过程会导致西黄丸中有效成分的改变和破坏的可能。因此古人将西黄丸定位于丸剂，确有其合理性和科学性。
       4.2  西黄丸血清药理学实验方法的问题血清药理学的实验方法1984年由日本学者田代真一首次提出［4，5］，它是将中药复方制剂先给动物喂服后，定时采集动物血液，分离血清，将这种血清视为含药血清，然后将含药血清加入体外培养体系内，用以考察中药复方药效和机理。理论上这种方法能在一定程度上地反映中药复方在体内的血药浓度，更接近药物在体内环境中的真实过程，同时可排除中药粗制剂中诸多因素的干扰，因此在中药复方的体外研究中得到许多学者们的响应。本研究中采用的含药血清制备方法，参照国家自然科学基金重点项目《中药复方体外实验的方法学研究》文献提供的中药含药血清体外实验操作规程（建议草案）的方法制备。
       
       但在本研究中，西黄丸含药血清未表现出抑瘤效应，相反，大鼠含药血清与正常的大鼠血清一样，在较高浓度时会促进肿瘤细胞的生长(P<0.05或P<0.01)，且呈浓度依赖性关系。
       
       众所周知，动物血清本身含有较多的生物活性物质，如生长因子等。在体外细胞培养中，动物血清是细胞正常生长所必需的营养成分之一（如常用的新生牛血清）。因此，用血清药理学实验方法来考察药物的体外抑瘤作用，同样存在血清中的活性物质对药效评价造成干扰的可能。这种干扰在我们的研究中是明显的存在的，即动物血清本身就具有一定的促进细胞生长的作用。而这种促进作用可能会削弱，甚至掩盖药物对肿瘤细胞的抑制作用。目前血清药理学的研究方法还处在探索阶段，供体动物的选择、给药剂量及方案、采血的时间、血清的预处理、血清的添加量等诸多技术环节，还缺乏系统的研究和统一的规范，不便于控制实验结果的重复性。因此，血清药理学的研究方法是否适用于体外抑瘤实验，仍需进一步探讨。
       【参考文献】
         　　［1］何欣，黄立中. 西黄丸临床应用及实验研究进展［J］.湖南中医药导报，2003，9(4):82.
       
       ［2］任志强,汤丽英,易运辉. 西黄丸的临床应用［J］.中国医院药学杂志,1998,18(6):260.
       
       ［3］中药复方体外实验的方法学研究［M］.北京：中国中医研究院中药研究所，2000：80.
       
       ［4］田代真一,友金干视,小川真奈,等.尿路カテテル尿量连续测定 汉方药理学、药物动态学应用［J］.和汉医药学会志,1988,5:528.
       
       ［5］田代真一.血清药理学血清药化学［J］.现代东洋医学,1992,13(1):113.