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       【摘要】 
       目的根据丹参酮ⅡA的性质，按生物药剂学系统对其进行分类，并考查了不同类型的促进剂对丹参酮ⅡA溶解性和渗透性的影响，为丹参酮ⅡA口服剂型的设计提供依据。方法运用热力学的方法测定丹参酮ⅡA在不同pH水溶液中的溶解度，考查常用高分子材料以及表面活性剂对丹参酮ⅡA溶解度的影响。用大鼠在体实验研究丹参酮ⅡA的小肠渗透性，考查不同类型的促进剂对丹参酮ⅡA渗透性的影响。结果丹参酮ⅡA在水及不同pH水溶液中的溶解度较低，不同浓度的羟丙基-β-环糊精能显著改善丹参酮ⅡA的溶解性。丹参酮ⅡA在大鼠小肠的渗透系数为：（0.960±0.019）×10-5 cm·s-1，羟丙基-β-环糊精、十二烷基硫酸钠，吐温-80、去氧胆酸钠、Labrasol都能明显增加丹参酮ⅡA的渗透性，其中羟丙基-β-环糊精的促渗效果最为明显。结论丹参酮ⅡA的溶解性和渗透性均较差，以溶解度和渗透性为指标筛选出的高分子材料以及表面活性剂能明显改善丹参酮ⅡA的溶解性和渗透性。
       【关键词】  丹参酮ⅡA；溶解度； 渗透性； 生物药剂学分类
       Study on the Solubility and Permeability of TanshinoneⅡA and on the Excipients Increasing the Solubility and Permeability
       Li Suchun, Liu Jianping*,ZENG Zhaozheng,ZHENG Yixuan
       （China Pharmacological University, Nanjing, 210009, China）
       Abstract：ObjectiveThe present investigation attempts to increase the solubility and permeability of tanshinone ⅡA according to the biopharmaceutical classification system(BCS) of tanshinone ⅡA. MethodsThe solubility of tanshinonⅡA in water and water solution with different pH was determined using thermodynamics method. Also the effects of certain macromolecules and surfactant on the solubility of tanshinoneⅡA were considered. The permeability of tanshinoneⅡA was determined by in situ single-pass intestinal perfusion model. Meanwhile the effects of different absorption enhancers on the permeation of tanshinonⅡA were evaluated.Results The solubility of tanshinoneⅡA in water and water solution with different pH is low,but the solubility is extremely increased by HP-β-CD. The permeability of tanshinoneⅡA across rat intestine was (0.960±0.019)×10-5 cm·s-1. The permeability was extremely increased by SD, SDS, Labrasol, Tween80 especially HP-β-CD. ConclusionThe solubility and permeability of tanshinoneⅡA is increased by certain macromolecules and surfactant.
       Key words：TanshinoneⅡA;   Solubility;   Permeability;   Biopharmaceutical classification system
        丹参酮ⅡA（TanshinoneⅡA）是唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Beg中的主要活性成分之一，为菲醌类衍生物。丹参酮ⅡA主要用于治疗冠心病、心绞痛、心肌梗塞等心血管疾病，近些年发现丹参酮ⅡA还具有抗菌消炎、抗氧化和抗肿瘤等作用［1～3］。研究发现，丹参酮ⅡA口服吸收较差，其绝对生物利用度低于3.5%［4］，因而其临床疗效受到影响。
       
       药物的溶解性和渗透性是影响药物吸收的两个重要参数，本文根据生物药剂学的原理和方法，从药物的溶解性和渗透性入手，分析探讨影响丹参酮ⅡA生物利用度低的关键因素，研究常用的高分子材料和表面活性剂对丹参酮ⅡA的溶解性和渗透性的促进作用，为丹参酮ⅡA口服剂型的设计提供依据。
       1  材料
       1.1 仪器
       HL-2型恒流蠕动泵（上海沪西生化仪器厂）；LC-10AT VP高效液相色谱仪（SHIMADZU）；XW-80A型旋涡混合器（上海医科大学仪器厂）；Sartorius电子天平（北京赛多利斯天平有限公司）；水摇床（江苏国胜仪器厂）。
       1.2  试剂
       丹参酮ⅡA  (实验室提取精制)；十二烷基硫酸钠（SLS, 分析纯，上海慧婷精细化学品有限公司）；吐温-80（Tween80,江苏晨牌药业有限公司）；Labrasol（佳法塞公司）；去氧胆酸钠(SD,美国Amresco 公司)；羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD，西安德立生物化工有限公司)；聚乙二醇-6000（PEG-6000,上海化学试剂站进口分装）；聚乙烯吡咯烷酮K30（PVP K30 ,德国BASF）；poloxamer188(F68，德国BASF)；甲醇为色谱纯，其它试剂均为分析纯。
        Krebs-Ringer缓冲液，取氯化钠7.8 g，氯化钾0.35 g，氯化钙0.37 g，碳酸氢钠1.37 g，磷酸二氢钠0.22 g，氯化镁0.22 g和葡萄糖1.4 g，置1 000 ml量瓶中，蒸馏水溶解并稀释至刻度，即得。
       1.3  动物SD大鼠，雄性，体重（250±30 ）g，由中国药科大学实验动物中心提供。
       2 方法
       2.1  丹参酮ⅡA溶解性考查
       2.1.1  丹参酮ⅡA在不同pH水溶液中溶解度的考查
       分别配制pH为1.2，2.5，4.5，6.8，7.4的缓冲溶液，取蒸馏水及上述液体2 ml置于10 ml带塞离心管中，加入过量的丹参酮ⅡA细粉，充分混匀，于摇床中，水浴37℃，100 r·min-1条件下平衡72 h，使其充分溶解，所得混悬液经0.45 μm微孔滤膜过滤，取续虑液测定，计算溶解度。每种浓度做3份样，取其平均值。
       2.1.2 高分子材料对丹参酮ⅡA溶解度的影响 
       分别配制浓度为2.5%，5.0%，7.5%和10%的PEG6000，PVP-K30和HP-β-CD溶液。依照“2.1.1”项下方法测定。每种浓度测定3次，取其平均值。
       2.1.3 表面活性剂对丹参酮ⅡA溶解度的影响  
       分别配制浓度为0.5%，1.0%的SLS，F68，Labrasol，Tween-80，SD溶液。依照“2.1.1”项下方法测定。每种浓度测定3次，取其平均值。
       2.1.4 不同pH水溶液中丹参酮ⅡA浓度的测定
       采用HPLC法，色谱条件为：Skim-pack VP-ODS（150 mm×4.6 mm）色谱柱，甲醇-水（85∶15），流速为1 ml·min-1，检测波长270 nm，进样量20 μl，以峰面积定量。本色谱条件下，溶解介质对丹参酮ⅡA的含量测定无干扰。在1～10 ng·ml-1范围内，丹参酮ⅡA的峰面积（A）与浓度（C）之间有良好的线性关系,标准曲线方程为:A=500.2C+470.75,r=0.999 8。低、中、高3种不同浓度溶液的平均回收率分别为100.1%，99.6%，99.5%，RSD分别为1.0%，0.4%，0.6%。低、中、高 3个浓度的日间差和日内差RSD均小于2%。
       2.1.5 不同溶解介质中丹参酮ⅡA浓度的测定
       采用HPLC法，色谱条件为：Skim-pack VP-ODS（150 mm×4.6 mm）色谱柱，甲醇-水（85∶15），流速为1 ml·min-1，检测波长270 nm，进样量20 μl，以峰面积定量。本色谱条件下，溶解介质对丹参酮ⅡA的含量测定无干扰。在0.5～8 μg·ml-1范围内，丹参酮ⅡA的峰面积（A）与浓度（C）之间有良好的线性关系，标准曲线方程为:A=121 142C+470.75,r=0.999 8。低、中、高 3 种不同浓度溶液的平均回收率分别为100.3%，99.5%，99.5%，RSD分别为1.0%，0.4%，0.1%，低、中、高 3 个浓度的日间差和日内差RSD均小于2%。
       2.2 丹参酮ⅡA渗透性考查
       2.2.1 丹参酮ⅡA在大鼠小肠渗透性的考查
        
       将禁食12 h以上的大鼠一只，用乌拉坦(1.2 g/kg)麻醉，背部固定，打开腹腔，离幽门15 cm处，取10 cm的肠段（空肠），肠段两端切口后，插管并结扎。用37℃的生理盐水以2.5 ml/min的速度将肠内容物冲洗干净，再用空气将生理盐水排空，装好装置。取预热的37℃的含丹参酮ⅡA 4 μg/ml的回流液 50 ml,以0.2 ml/min的流速灌流30 min,收集流出液并开始计时，每隔20 min分段收集流出液，并精确量取流出液体积和供试液减少的体积数。实验共收集5次流出液，实验结束后，用空气排空管道，收集流出液，再测量小肠的面积。按下式计算表观渗透系数
       
       Kapp=Qxln(CinQin/CoutQout)/A（1）
       式（1）中：Qin和Qout分别为肠道进出口灌流液的体积（ml）；Cin和Cout分别为肠道进出口灌流液的浓度（μg·ml-1）；Q为灌流速度（ml·min-1）；A为小肠吸收面积（cm2）。
       2.2.2 高分子材料对丹参酮ⅡA渗透性的影响
        
       配制浓度为5%，10%和15%的HP-β-CD，称取定量丹参酮ⅡA粉末，分别加入上述溶液中，配制成4 μg/ml溶液，按照“2.2.1”项下方法测定，计算表观渗透系数。
       2.2.3 表面活性剂对丹参酮ⅡA渗透性的影响
       配置浓度为1.0%的SLS，Tween80，Labrasol，SD，称取定量丹参酮ⅡA粉末，分别加入上述溶液中，配制成4 μg/ml溶液，按照“2.2.1”项下方法测定，计算表观渗透系数。
       2.2.4 肠液中丹参酮ⅡA的含量测定 
       采用HPLC法。色谱条件：Skim-pack VP-ODS(150 mm×4.6 mm)色谱柱，流动相为甲醇-水（85∶15），流速1 ml·min-1，检测波长270 nm，进样量20  μl，以峰面积定量。Krebs-Ringer缓冲液对丹参酮ⅡA含量测定无干扰，药用辅料也不干扰丹参酮ⅡA含量的测定。以甲醇： Krebs-Ringer缓冲液(体积比1∶1)为溶剂系统溶解丹参酮ⅡA对照品，做标准曲线。在0.5～8 μg·ml-1范围内,丹参酮ⅡA的峰面积(A)与浓度(C)之间有良好的线性关系，标准曲线方程为：A=56 825C-3 032.2，r=0.999 8。低、中、高 3 种不同浓度的平均回收率分别为105.5%，99.9%，100.8%，RSD%分别为2.1%，0.7%，0.3%。低、中、高三浓度日内差以及日间差RSD%均小于2%。
       3  结果
       3.1  丹参酮ⅡA在不同pH水溶液中的溶解度 
       丹参酮ⅡA在水中以及不同pH溶液中的溶解度如表1，丹参酮ⅡA水中溶解度为2.8 ng/ml，属于水不溶性物质，在酸性及中性的不同pH介质中溶解度也很小，丹参酮ⅡA低溶解度直接影响了药物在体内的吸收，从而影响丹参酮ⅡA生物利用度。表1  丹参酮ⅡA在37℃水以及不同pH缓冲液中的溶解度（略）
       3.2 丹参酮ⅡA的小肠渗透性
       丹参酮ⅡA单向灌流120 min后，根据式（1）计算丹参酮ⅡA的渗透系数为：（0.960±0.019）×10-5 cm·s-1。文献报道［5］ 当大鼠空肠的渗透系数Kapp＜0.03×10-4 cm·s-1时药物难以吸收，当大鼠空肠的渗透系数Kapp＞0.2×10-4 cm·s-1时药物易于吸收。据此可认为，丹参酮ⅡA属于难吸收性药物，这说明其低渗透性可能是导致生物利用度低的主要原因之一。
       3.3 不同高分子材料以及表面活性剂对丹参酮ⅡA溶解性的影响 
       丹参酮ⅡA在水中以及胃肠道pH条件下的溶解度很低，使得丹参酮ⅡA的溶出成为其体内吸收的限速过程，这是影响其生物利用度的重要原因。只有在增溶后提高丹参酮ⅡA的溶解度，才能确保丹参酮ⅡA的溶出过程不构成其体内吸收的限速步骤。不同浓度高分子材料PEG6000，PVP-k30和HP-β-CD；表面活控剂SLS，poloxamer188，Labrasol，Tween80和SD对丹参酮ⅡA都有一定的增溶性，如图1。由图可知高分子材料中HP-β-CD有显著增溶效果（P＜0.05），2.5%，5.0%，7.5%，10%的HP-β-CD，分别使丹参酮ⅡA的溶解度提高了2 365，4 625，7 130以及17 963倍。表面活性剂中SLS增溶效果最显著（P＜0.05），0.5%,1.0% SLS分别使丹参酮ⅡA的溶解度提高了6 850, 11 975倍。
       3.4 不同类型吸收促进剂对丹参酮ⅡA渗透性的影响 
       高分子物质，表面活性剂等很多辅料常作为药物在小肠吸收的促进剂［6］。各类吸收促进剂对丹参酮ⅡA的大鼠在体吸收累积量影响如图2、图3所示。图2显示不同浓度HP-β-CD对丹参酮ⅡA有明显促渗作用（P<0.05），且随着HP-β-CD浓度的增加，促渗作用也随之增加。另一方面，在HP-β-CD较高浓度时，如15%的HP-β-CD相对于10%的HP-β-CD促渗作用并不显著（P>0.05）。考虑到过量使用促渗剂可能影响小肠的正常形态与功能，故选择10% HP-β-CD作为最佳促渗浓度。图3是不同表面活性剂的促渗透情况，所考查的各种表面活性剂均有显著的促渗作用（P<0.05），其中Labrasol促渗效果最为显著，而SLS，Tween80和SD促渗效果相对较低，且三者之间无明显差别（P＞0.05）。丹参酮ⅡA以及含有不同促渗剂的丹参酮ⅡA的渗透系数如图4所示，从图4中可见，5%HP-β-CD渗透系数提高了1.5倍,10%HP-β-CD提高了1.8倍,15%HP-β-CD提高了2倍。表面活性剂1%SLS提高了1.38倍,1%Tween80提高了1.43倍,1%SD提高了1.45倍,1%Labrasol提高了1.5倍。
       4 讨论
       
       本课题研究首次将美国FDA指导新药研究的生物药剂学分类系统运用到丹参酮ⅡA的吸收预测和剂型设计中。生物药剂学分类系统依据药物的溶解性和渗透性特征，将药物分成四种类型：溶解性及渗透性均较好的化合物属于Ⅰ类，溶解性低而渗透性高的化合物属于第Ⅱ类，溶解性高但渗透性低的化合物属于第Ⅲ类，溶解性和渗透性均较低的化合物属于第Ⅳ类。 实验结果表明丹参酮ⅡA溶解度和渗透性均较低，根据上述分类方法［7］，丹参酮ⅡA属于第Ⅳ类化合物。因此，必须同时提高溶解度和渗透性才能提高其生物利用度。
       
       固体分散技术、包合技术和表面活性技术是 3 种可微量化操作、快速简便、无特异性的增溶技术，可应用于中药活性成分尤其是难溶性成分的研究。PEG6000，PVP-k30具有良好的溶解性，是制备固体分散体的常用载体；HP-β-CD是常用的包合材料；poloxamer188，SLS，SD，Labrasol，Tween80是常用的表面活性剂。本文运用热力学方法和单向灌流技术，筛选出既可增溶又可促渗的高分子材料和表面活性剂来增加药物的吸收。高分子材料中HP-β-CD的增溶促渗效果较好。这是由于HP-β-CD具有特殊结构，其亲脂性的洞穴结构易容纳非极性药物，显著增加了丹参酮ⅡA的溶解性。有文献报道［8］HP-β-CD的促渗机理为HP-β-CD包裹亲脂性药物通过细胞间转运，从而改善了亲脂性药物的体内吸收。本课题研究中，HP-β-CD促进了丹参酮ⅡA的渗透与文献报道的HP-β-CD促渗机理相符。可以考虑采用制备丹参酮ⅡA包合物的方法来提高丹参酮ⅡA的生物利用度。所考查的表面活性剂中，除poloxamer188之外，其他表面活性剂都既具有增溶作用又具有促渗作用。SDS，SD，Labrasol ，Tween80是微粒体给药系统如胶束、纳米乳、微乳给药系统的常用辅料。因此本课题研究，为丹参酮ⅡA剂型设计提供了重要的实验基础。
       
       本课题研究采用了国外普遍运用的单向灌流技术，用于研究药物在大鼠小肠的吸收情况。单向灌流技术可以模拟口服药后正常的体内环境，保持一定的药物浓度和完整的血流供应，吸收速率稳定，与人体内吸收具有良好的相关性。
       【参考文献】
         　　［1］Wang X, Wei Y, Yuan S, Lu Y, et al. Potential anticancer activity of tanshinone ⅡA against human breast cancer［J］. Int. J. Cancer, 2005, 116(5): 799.
       
       ［2］Kim HH, Kim JH, Kwak HB, et al. Inhibition of osteoclast differentiation and bone resorption by tanshinone ⅡA isolated from Salvia miltiorrhiza Bunge［J］. Biochem Pharmacol 2004, 67(9): 1647.
       
       ［3］Lam BY, Lo AC, Sun X, et al. Neuroprotective effects of transient focal cerebral ischemia in mice ［J］. Phtomedicine, 2003, 10(4): 286.
       
       ［4］Haiping Hao, Guangji Wang, Nan Cui, et al. Pharmacokinetics, absorption and tissue distribution of tanshinone ⅡA solid ［J］. Planta Med, 2006, 72(14): 1311.
       
       ［5］Fagerholm U, Johansson M and Lennernas H, Comparison between permeability coefficients in rat and human jejunum［J］. Pharm Res, 1996, 13(9):336.
       
       ［6］Aungst BJ. Intestinal Permeation Enhancers［J］. Pharm Sci, 2000, 89(4): 429.
       
       ［7］Amidon GL, Lennerns H, Shah VP, et al. A Theoretical Basis for a Biopharmaceutic Drug Classification: The Correlation of in Vitro Drug Product Dissolution and in Vivo Bioavailability［J］. Pharm Res, 1995, 12(3): 413.
       
       ［8］Sharma P, Varma MV, Chawla HP, et al. Absorption enhancement, mechanistic and toxicity studies of medium chain fatty acids, cyclodextrins and bile salts as peroral absorption enhancers［J］. Farmaco, 2005, 60(11-12): 884.