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       【摘要】 
       目的建立反相高效液相色谱法测定季德胜蛇药片中重楼皂苷I的含量。方法采用Agilent Zorbax SB C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为乙腈－水（45∶55）；流速1.0 ml/min，柱温30℃，检测波长为210 nm。结果重楼皂苷I在0.009 645～0.964 5 mg/ml范围内与峰面积呈良好的线性关系，r=1.000 0；平均加样回收率为99.21％，RSD为0.75％（n＝9）。结论该法简便、准确，重复性较好，可用于测定季德胜蛇药片中重楼皂苷I的含量。
       【关键词】  重楼皂苷Ⅰ；季德胜蛇药片； 高效液相色谱
       Determination of Chonglou Saponin I in Jidesheng Sheyao Tablets by RP－HPLC
       CAO Ling，FAN Xialei，WAN Rong
       （1.Jiangsu Institute for Drug Control，Nanjing  210008,China； 2. School of Science, Nanjing University of Industry, Nanjing 210009,China)
       Abstract:ObjectiveTo develop an HPLC method for determination of Chonglou Saponin I in Jidesheng Sheyao tablets. Methods The HPLC method was used with Agilent Zorbax SB C18 column（4.6 mm×250 mm，5 mm）, the mobile phase was acetonitrile-water (45∶55) and the flow rate was 1.0 ml/min. The detection wavelength was 210 nm. ResultsThe method had good linear relationship within the range of 0.009 645～0.964 5 mg/ml. The average recovery was 99.21%（RSD=0.75%，n=9).ConclusionThe method is simple，accurate and reliable. It is appropriate for the determination of Chonglou Saponin I in Jidesheng Sheyao tablets.
       Key words:Chonglou Saponin I；  Jidesheng Sheyao tablets；  HPLC
       
       季德胜蛇药片由七叶一枝花、蟾酥皮、蜈蚣、地锦草等药味制成，具有清热、解毒、消肿止痛的功效，用于治疗毒蛇、毒虫咬伤。该品种为中药保护品种，目前收载于《中华人民共和国卫生部药品标准·中药成方制剂》第15册［1］，其中尚无含量测定方法。因其处方中的七叶一枝花的活性成分具有抗肿瘤、消肿止痛、抑菌、镇静、镇痛、止血等作用［2］，本实验采用反相高效液相色谱法，选择七叶一枝花中的重楼皂苷I作为指标性成分，对该片剂的质量进行控制。
       1 仪器与试药
        Agilent1100高效液相色谱仪（包括在线脱气机，二元梯度泵，自动进样器，柱温箱，DAD检测器）；重楼皂苷I对照品为中国药品生物制品检定所提供（批号110731-200511，供含量测定用）。季德胜蛇药片由江苏精华制药有限公司提供（规格0.4 g，批号060607，060608，060618，060733）。乙腈为色谱纯，水为去离子蒸馏水，其余试剂均为分析纯。
       2 方法与结果［3］
       2.1  色谱条件
       色谱柱：Agilent Zorbax SB C18柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流动相：乙腈-水（45∶55）；流速1.0 ml/min；检测波长210 nm；柱温30℃；进样量20 ml。
       2.2  对照品溶液的制备
       精密称取经40℃减压干燥2 h的重楼皂苷I对照品适量，加甲醇溶解并稀释制成每毫升中含0.1 mg的溶液，即得。
       2.3   供试品溶液的制备
       取本品20片，研细，精密称取2.0 g，置100 ml具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 ml，密塞，称定重量，超声处理40  min（功率250 W，频率40 kHz），放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。 
       2.4  阴性对照溶液的制备
       按处方比例制备不含重楼的阴性样品，照供试品溶液的制备方法制备阴性对照溶液。
       2.5  专属性实验
       在以上的色谱条件下，重楼皂苷I的保留时间约为25 min，理论板数按重楼皂苷I峰计算为12 148，阴性对照溶液在重楼皂苷I对照品相应的保留时间处无干扰，供试品溶液中重楼皂苷I峰和相邻色谱峰间完全分离。色谱图见图1。
       2.6  峰纯度检测
       应用二极管阵列检测器和色谱工作站系统对所测组分色谱峰进行分析，供试品溶液中重楼皂苷I峰的纯度系数（purity index）为996.710，表明峰纯度很高。
       2.7  检测限及定量限取对照品溶液稀释若干倍进样，记录主药峰高约为噪音峰高3倍时的色谱图，测得重楼皂苷I的检测限为16.4 ng；记录主药峰高约为噪音峰高10倍时的色谱图，测得重楼皂苷I的定量限为48.2 ng。
       2.8  线性实验精密称取重楼皂苷I对照品19.29 mg，置20 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度。精密量取适量，分别用甲醇稀释成每毫升中含9.645，19.29，48.225，96.45，192.9，385.8，578.7，771.6 μg的溶液，摇匀，精密量取20 μl注入液相色谱仪，测定峰面积，以峰面积A为纵坐标，重楼皂苷I浓度C（mg/ml）为横坐标，进行线性回归，得回归方程为：
       
       A=3264.954 4C-7.9411，r=1.000 0（n=9）
       
       表明重楼皂苷I浓度在0.009 645～964.5 mg/ml 范围内与峰面积呈良好的线性关系。
       2.9  进样精密度实验取对照品溶液和供试品溶液分别重复进样6次，测定重楼皂苷I的峰面积，计算RSD分别为0.39％与0.29%。表明进样精密度良好。
       2.10  日间精密度实验取同一批样品，分别于不同日期进行精密度实验，计算日间误差。结果见表1。表1  日间精密度结果（略）
       2.11 重复性实验取同一批样品（060608），平行制备6份供试品溶液，分别测定。重楼皂苷I的平均含量为1.334 mg/g，RSD为1.41%。表明方法的重复性较好。
       2.12 溶液稳定性实验 取供试品溶液自配制后分别在0，1，3，6，9，12，24 h测定峰面积，RSD为0.45％，表明该溶液在24 h内稳定。
       2.13  加样回收率实验采用加样回收法，取已知含量的样品（批号060608）适量，置100 ml锥形瓶中，分别精密加入重楼皂苷I对照品适量，依法测定含量，测得重楼皂苷I的平均回收率为99.21%，RSD为0.75%。结果见表2。表2   加样回收率实验结果（略）
       2.14 含量测定取样品，照“2.3”项下方法制备，依法测定含量。结果见表3。表3   含量测定结果（略）
       3  讨论
        供试品溶液制备时，分别采用不同的提取溶剂（甲醇、乙醇、70%甲醇）、不同提取方法（热回流、超声提取）、不同溶剂用量（15，25，50 ml）和不同提取时间（20，30，40，50 min）进行了考察，结果表明，取本品2.0 g，用甲醇25 ml超声提取40 min，操作简便，提取效率最高。     
       
       分别采用3根不同填料的色谱柱〔UltimateTM XB C18柱、Phenomenex Luna(2) C18柱、Agilent Zorbax SB C18柱〕，两台仪器（Waters 2695，HP1100）进行实验，结果重楼皂苷Ｉ均能与其它色谱峰完全达到基线分离，且同一批样品含量的RSD为1.35%，可用于本法检测。
       
       对色谱系统的耐用性进行了考察，分别采用不同流速（0.8，1.0，1.05 ml/min），不同柱温（30，35，40℃）、不同流动相比例（乙腈∶水=43∶57，45∶55，47∶53）进行了实验，结果分离均良好。本方法专属性强，重复性好，灵敏度高，适用于季德胜蛇药片中重楼皂苷I的检测。
       【参考文献】
         　　［1］中华人民共和国卫生部药典委员会，中华人民共和国卫生部药品标准·中药成方制剂,第15册［S］.1997：107.
       
       ［2］李惠芬，平渊，陈刚，等. 高效液相色谱法和薄层色谱法测定重楼皂苷中薯蓣皂苷元的含量［J］.中草药，2003，34（2）：127.
       
       ［3］龙国友，杨云，鲁静. HPLC法测定热毒清片中重楼皂苷I的含量［J］.中成药，2005，27（10）：1155.