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       【摘要】 
       目的跟踪确定中药桂枝中的抗过敏活性成分。方法桂枝通过70%乙醇溶液提取，不同有机溶剂萃取及大孔树脂HP-20、聚酰胺和Sephadex LH-20对样品进行纯化，以透明质酸酶抑制率为指标对各组分抗过敏活性进行跟踪，确定抗过敏活性最强的组分，通过薄层层析、显色反应和光谱鉴定对抗过敏活性最强的组分定性。结果桂枝大孔树脂40%乙醇洗脱部分的酶抑制率为62.3%，过聚酰胺40%丙酮洗脱部分酶抑制率达到73%，过凝胶甲醇洗脱后，活性成分酶抑制率最高达93%。结论桂枝中强过敏组分为缩合类单宁
       【关键词】  桂枝；透明质酸酶； 缩合类单宁
       Study on the Antiallergic Components of Ramulus  Cinnamomi
       NIE Qisen， TENG Jianwen， HUANG Li， WEI Baoyao*， GUO Jinlong
       （The Institute of Light Industry and Food Engineering,Guangxi University,Nanning 530004,China）
       Abstract：ObjectiveTo track and ascertain the antiallergic components of Ramulus Cinnamomi.MethodsIt was extracted by 70% ethanol and organic solvents by turns,then purified by Diaion HP-20,polyamide and Sephadex LH-20.At the same time, the antiallergic activity was carried out by measuring the inhibition rate on hyaluronidase .Then the best antiallergic components were ascertained by TLC,color reaction and spectrum certification. ResultsThe rate of Ramulus Cinnamomi extract purified by Diaion HP-20 and eluted by 40% ethanol was 62.28%, purified by polyamide and eluted by 40% acetone was 73%， purified by Sephadex LH-20 and eluted by methanol was 93%.ConclusionThe best antiallergic components of  Ramulus Cinnamomi are condensed tannins.
       Key words：Ramulus Cinnamomi;  Hyaluronidase;  Condensed tannins
       
       近十几年来，随着物质生活水平的提高，环境社会因素的影响，过敏性疾病越来越多，其发病率不断上升。据统计过敏患者已占世界人口的40％。20％以上的美国人都曾受到过敏性疾病的困扰；日本厚生省过敏综合研究报告显示，35％的小儿和22％的成人都曾患过不同程度的花粉症、过敏性皮炎、哮喘、鼻炎等过敏性疾病；在我国，过敏反应的发病率约占10％，且呈逐年上升的趋势。根据免疫反应机理，过敏反应分为Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型和Ⅳ型，大多数过敏反应是与体内透明质酸酶活性有关的Ⅰ型过敏反应［1］。目前，世界各国治疗过敏反应的药物都存在毒副作用大的缺点，从天然植物中提取抗过敏的活性成分，因具有低毒高效的作用效果，越来越受到人们的青睐， 可作为新型的食品添加剂和药物原料，用于保健食品和新药的研究开发。
       
       桂枝为樟科植物肉桂Cinnamomum cassia Pres1的干燥嫩茎，临床上多用于缓和肠胃刺激、强心、改善微循环、抗炎、抗血小板凝集等［2］。桂枝在抗过敏方面的研究主要是桂枝汤合方或桂枝汤的应用。临床应用桂枝汤治疔过敏反应以及抑制炎症反应获得明显疗效。现代药理研究表明， 桂枝对嗜异性抗体反应显示出抑制补体活性作用，故其有较强抗过敏作用［3］。国内外研究已证明桂枝具有抗过敏作用，但对桂枝的具体的抗过敏活性成分还鲜有报道。本文对桂枝的抗过敏活性成分进行了分离纯化和初步鉴定，以透明质酸酶抑制率为指标进行活性跟踪，为桂枝的进一步开发提供理论依据。
       1   器材与方法
       1.1  仪器与试剂桂枝 ：市售，产地为广西；试剂：大孔树脂HP-20，北京绿百草公司；聚酰胺（60～100目），浙江台州市路桥四甲生化塑料厂；葡聚糖凝胶Sephadex LH -20，Amersham bioscisences 公司 ；透明质酸酶（500U/mg）、透明质酸钾，Simga公司；对二甲氨基苯甲醛（DBMA），上海试剂二厂；乙酰丙酮：天津试剂厂；钨酸钠、磷钼酸、磷酸：南宁蓝天试剂有限公司；醋酸、石油醚、氯仿、醋酸乙酯、正丁醇、乙醇等均为分析纯。
       
       仪器： RE-52A旋转蒸发仪；GSY-Ⅱ恒温水浴箱；UV-1601PC紫外分光光度计；LABCONCO真空冷冻干燥系统；XWT-S 小型台式纪录仪；全自动点样仪。
       1.2  抗过敏活性成分的提取和纯化
       1.2.1  桂枝有效成分的粗提取取桂枝样品粉碎，过20目筛，方案1用石油醚热回流提取3h，方案2用醋酸乙酯热回流提取3 h，方案3为用70%乙醇溶液70℃提取1 h。各方案分别重复提取3次，合并提取液，对3种粗提方案的提取液真空浓缩、冷冻干燥，分别得到样品桂1，桂2，桂3，分别对各样品进行透明质酸酶实验。
       1.2.2  桂枝粗提物的萃取分离
       将透明质酸酶抑制率最强组分溶解，依次用氯仿、醋酸乙酯、正丁醇进行萃取，得到氯仿相、醋酸乙酯相、正丁醇相、剩余水相4种成分的萃取液，经真空浓缩，冷冻干燥得到样品桂4，桂5，桂6，桂7，分别对样品进行透明质酸酶实验。
       1.2.3  大孔树脂对有效成分的纯化大孔树脂（Diaion HP-20）装柱，柱长70 cm,内径5.0 cm,先用蒸馏水以1BV/h的流速清洗4BV，以4%HCl溶液清洗2 BV，用蒸馏水洗脱至中性，再以3%NaOH溶液洗2 BV，再以蒸馏水洗脱至中性。将桂枝透明质酸酶抑制率最强萃取组分进行溶解吸附， 依次用蒸馏水、10%乙醇、40%乙醇、70%乙醇梯度洗脱，洗脱体积分别为2BV，2BV，3BV，2BV，流速为1BV/h 。依次收集洗脱组分，减压浓缩，冷冻干燥，分别得到样品桂8、桂9 、桂10、桂11，分别对样品进行透明质酸酶实验。
       1.2.4  聚酰胺对有效成分的进一步纯化  将用95%乙醇浸泡除去气泡的聚酰胺装柱，柱长49 cm，内径2.5 cm，先用95%乙醇以1BV/h的流速清洗4BV，以5%的氢氧化钠溶液清洗2 BV，再以10%的醋酸水溶液清洗2 BV，最后用蒸馏水洗脱至中性，将过大孔后桂枝透明质酸酶抑制率最强组分进行溶解吸附，依次用20%，40%，60%丙酮梯度洗脱，洗脱体积各2 BV，流速为1 BV/h。依次收集洗脱组分，减压浓缩，冷冻干燥，分别得到样品桂12、桂13、 桂14，分别对样品进行透明质酸酶实验。
       1.2.5 总酚含量的测定-采用 Folin-Ciocalteau法［4］采用Folin-Ciocalteu试剂进行测定，以没食子酸为标准物。按照参考文献［4］测定，以吸光值（A765 nm）为纵坐标，以没食子酸浓度（mg/L）为横坐标绘制标准曲线，得回归方程： Y=0.116 6X-0.004 7，R2=0.999 6。精确量取1 ml样液在同等条件下操作，测其吸光度。根据标准曲线计算总酚含量。
       1.2.6 葡聚糖凝胶Sephadex LH-20对有效成分的进一步纯化  凝胶装柱，柱长44 cm，内径2.2 cm，流速为1  ml/min，称取聚酰胺分离后透明质酸酶抑制率最强组分样品0.1 g，用少量甲醇溶解。将溶液全部转移到Sephadex LH-20凝胶柱，用甲醇洗脱,根据色谱峰对洗脱样品进行收集，减压浓缩，冷冻干燥，分别得到样品桂15、桂16，测定透明质酸酶抑制率。
       1.2.7 透明质酸酶抑制实验-采用Elson-Morgan法［5～7］透明质酸酶抑制率（%）=［（A-B）-（C-D）］/（A-B）×100%
       
       式中：A为对照溶液的OD值  B为对照空白溶液的OD值；C为试样溶液的OD值  D为试样空白的OD值
       1.3  抗过敏活性成分的初步鉴定对过凝胶后抗过敏活性最强组分进行鉴定。
       1.3.1  薄板层析定性鉴定［8］和显色反应［9］取样品适量，配制成甲醇溶液，使用点样器点样，在层析缸中，由醋酸乙酯∶甲酸∶水（9∶0.6∶0.4）溶液上行展开到终点后，取出，依次用2%FeCl3溶液和茴香醛-硫酸溶液显色；取样品溶液与明胶溶液、溴水、香草醛－盐酸溶液和浓硫酸进行显色反应，观察现象。
       1.3.2 光谱的定性鉴定［10］紫外可见光谱的扫描范围是200～800 nm；红外扫描范围400～4 000 cm-1。
       2  结果
       2.1  桂枝的粗提方法的确定使用3种方案对桂枝进行粗提，提取样品进行透明质酸酶实验。从表1可以看出，采用70%乙醇溶液提取得到的桂枝粗提物即样3的透明质酸酶抑制率最高，提取率也最高，因此采用70%乙醇溶液对桂枝进行粗提。表1  桂枝不同粗提方法抗过敏活性和提取率比较（略）
        提取率（%）=样品干燥称质量/总称取量×100%
       2.2  桂枝粗提物的萃取分离对桂枝粗提物用不同极性的有机溶剂进行萃取分离，对各不同极性的组分进行透明质酸酶抑制率的测定，从图1可以看出，桂枝提取物有效成分集中在中等极性的醋酸乙酯部分（桂5），其抑制率为 44.7% ，而且它的回收率也相对较高为40.2%。
       2.3  大孔树脂对有效成分的纯化对萃取分离后得到的透明质酸酶抑制率最强的组分过大孔树脂，样品的总回收率达到85.3%。对得到的4个组分测定透明质酸酶抑制率，从图2 可以看出，桂枝提取物过大孔树脂后透明质酸酶抑制率得到了进一步的提高，其中以桂10即40%乙醇洗脱部分为最高，达到62.3%，回收率为45.2%。
       2.4  聚酰胺对有效成分的进一步纯化对于桂枝大孔树脂 40%乙醇洗脱组分过聚酰胺柱，对其进行进一步纯化，得到3个样品。从图3可以看出，样品过聚酰胺后透明质酸酶抑制率得到了进一步的提高，其中40%丙酮洗脱部分（桂13）达到了73%，属较强抗过敏组分，回收率也达到59%。测定桂13的多酚含量 为85%，由此可以预测其中抗过敏作用最强的成分主要为酚类物质，为以后的进一步纯化提供了理论上的帮助。
       2.5  葡聚糖凝胶SephadexLH -20对有效成分的进一步纯化对桂枝聚酰胺40%丙酮洗脱部分过凝胶柱，样品的总回收率为94%，记录的色谱峰为两个明显的肩峰组成，证明其组成可能为两种单体物质，得到样品测定透明质酸酶抑制率，桂15达到了93%，为强抗过敏组分。见图4。
       2.6  强抗过敏成分桂15的初步鉴定
       2.6.1  薄层层析定性鉴定桂15在薄板展开后，经三氯化铁溶液显色为暗绿色，表明含有酚羟基，斑点再经过茴香醛－浓硫酸溶液显色为橙色，呈现缩合单宁的特征。样品溶液进行试管预测，可使明胶溶液出现沉淀，使溴水混浊，可使香草醛－盐酸和浓硫酸显红色，这些都呈现缩合单宁的特征。
       2.6.2  样15的光谱定性鉴定由图5所示，样品在紫外光谱区有吸收，在可见光谱区基本无吸收，278 nm处有中等强度吸收峰，207 nm处有强吸收峰，说明分子中含有苯环，吸收谱带呈现典型的芳香官能团特征。
       3  结论
        实验结果表明桂枝提取物具有很高的透明质酸酶抑制率，具有强抗过敏作用，经过大孔树脂、聚酰胺纯化后，活性成分抑制率为73%，样品总酚含量为85%，经凝胶纯化后其抑制率达到了93%，属强抗过敏组分，通过薄层层析和显色反应确定此强抗过敏组分为缩合类丹宁，紫外、红外扫描进一步证实其结构中含有苯环，显示了芳香官能团的特征。结合樟科植物桂枝所含的化学成分推测可能为儿茶素、表儿茶素类及其二聚体到五聚体等单体化合物。
       
       虽然已经确定桂枝抗过敏组分为缩合类丹宁，但抗过敏作用的机制还没有提出，有待进一步研究。
       【参考文献】
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