文章标题 全文   多个检索词，请用空格间隔。

       【摘要】 
       目的研究胡椒中胡椒碱的超临界二氧化碳(SFE–CO2)萃取最佳工艺条件。方法 高效液相色谱（HPLC）法测定胡椒碱含量，以胡椒碱收率和浸膏中胡椒碱含量为指标，采用正交实验法对其SFE–CO2工艺进行优化，并与传统提取工艺进行比较。结果胡椒碱的SFE–CO2最佳条件为温度 60℃，压力30MPa，夹带剂用量1∶0.5（W/V），CO2流量5.6 L·h-1，萃取时间2 h。结论与其他方法相比，该法具有收率高、含量高、萃取时间短、溶剂易回收等优点。
       【关键词】  胡椒碱；超临界二氧化碳萃取； 正交实验
       Study on Supercritical CO2 Extraction Process of Piperine in Piper nigrum Linn by Orthogonal Design
       WANG Lihong, ZHOU Lili, LI Tong
       ( School of Pharmaceutical Engineering ，Shenyang Pharmaceutical University，Shenyang 110016, China)
       Abstract：ObjectiveTo study the optimum extraction parameters on piperine from Piper nigrum Linn . MethodsThe content of piperine in extract was determined by HPLC. With the content of piperine in extract and the extractive yeild of peperine as quality control criteria, the optimum conditions for supercritical CO2 fluid extraction (SFE–CO2) ,were investigated by orthogonal dasign, and the comparison methods among  SFE–CO2, mixed solvent extraction、ethanol extraction and chloroform were conducted.ResultsThe optimum extraction parameters were as follows:temperature of 60℃，pressure of 30MPa ,entrainer(w/v) of 1:0.5,CO2  volume of 5.6 L/h and extraction time of 2 h.ConclusionThe method has the advantages of rapid and efficient extraction ,good quality and no solvent residues in the extractors.
       Key words：Piperine;  Supercritical CO2 fluid extraction;  Orthogonal design;  HPLC
       
       胡椒Piper nigrum Linn为胡椒科胡椒属攀援状藤本，原产东亚，现广泛栽培于热带国家，在我国福建、广东、海南、广西、云南均有种植［1］。其性热，味辛，有温中散寒、下气、消痰之功效，主治胃寒呕吐，腹痛泄泻，食欲不振，癫痫痰多［2］。近年来的研究表明，其在镇痛、镇静、抗炎、抗惊厥、杀虫、抗癌等多方面存在活性。目前胡椒中含量及活性最高的胡椒碱的提取方法主要是有机溶剂提取法［3］。这些方法大都存在着溶剂用量大、提取时间长、提取率低、有效成分受破坏及有机溶剂残留等缺点。胡椒碱分子量为285.33，属中等极性，而且遇光不稳定，因此可采用超临界流体萃取方法进行提取。本研究采用超临界流体萃取技术对胡椒中的胡椒碱进行提取工艺的考察，并在此基础上进行工艺优化，研究其超临界提取物的分离工艺。
       1  材料与仪器
       1.1  材料
       液化CO2 ，沈阳景泉气体公司产品，纯度99.5％以上；甲醇（色谱纯），江苏汉帮科技有限公司产品；其他试剂均为分析纯。胡椒碱对照品，购自中国药品生物制品检定所。胡椒（产地：海南）：购买于沈阳市药材公司，经鉴定为胡椒科植物胡椒Piper nigrum Linn的干燥果实，将胡椒烘干，粉碎待用。
       1.2 仪器
       FZ102型小型植物粉碎机，天津泰斯特仪器有限公司产品；CLJ120–B–35–型超临界萃取装置，沈阳天诚超临界萃取有限公司产品；高效液相色谱仪(日本日立公司)：L-2130输液泵，L-2400紫外检测器，N-3000色谱工作站（浙江大学）。万分之一分析天平，北京赛多利斯天平。
       2  方法
       2.1  胡椒碱的含量测定
       2.1.1  色谱条件KromasilC18色谱柱（200 mm×4.6 mm i.d，5 μm），流动相甲醇-水（70∶30），流速1.0 ml·min-1，进样量20 μl，检测波长343 nm，柱温30℃。
       2.1.2  标准曲线及线性范围精密称取胡椒碱对照品10.5 mg，置于100 ml的量瓶中，加甲醇溶解，并定容至刻度。精密吸取此溶液1.0，2.0，4.0，5.0，6.0，8.0，9.0 ml置于10 ml量瓶中，甲醇定容，摇匀，按上述色谱条件，测定峰面积。以胡椒碱的进样量（M）对峰面积A进行线性回归，得回归方程为A=6.437 9×107 M -1.587×104，r＝0.999 ，线性范围为0.01～0.1 μg。
       2.1.3  供试品溶液的制备将萃取物减压浓缩，精密称取浸膏0.1～0.2 g，加适量甲醇，超声使之溶解后，定容至100 ml量瓶中，摇匀，0.45 μm微孔滤膜滤过，作为测定胡椒碱的样品溶液。
       2.2  药材中胡椒碱含量的测定精密称取胡椒粉0.25 g，置100 ml量瓶中，加无水乙醇约80 ml，超声处理至少30 min，定容，摇匀，滤过，将滤液稀释至一定浓度，测定胡椒碱峰面积，计算得药材中胡椒碱含量为5.36％。
       2.3  SFE–CO2工艺流程准确称取150 g胡椒粉投入超临界萃取釜中，当温度分别达到预定温度时，打开CO2气瓶送气，当压力达到预定压力时，调节流量，恒温恒压下开始萃取并开始计时，间隔一定时间从解析釜I、Ⅱ出口处收集萃取物。
       2.4  萃取物中胡椒碱的含量测定将SFE–CO2提取物按供试品溶液方法制备，测定胡椒碱的峰面积，计算胡椒碱的含量，并按照下式计算胡椒碱的收率：收率（%）＝浸膏中胡椒碱的质量/物料中胡椒碱的质量×100％。
       3  结果
       3.1  胡椒碱SFE–CO2的影响因素考察称取胡椒粗粉150 g，在萃取压力25 MPa，萃取温度50℃，CO2流量5.6 L/h的条件下，萃取2 h，仅得到少量浸膏。根据胡椒碱的溶解性，选择了甲醇、和醋酸乙酯为夹带剂，用量1∶0.2 (w/v)，在上述实验条件下，分别进行萃取。结果见表1。表1  夹带剂种类考察数据（略）
       结果表明，可选用95%乙醇为夹带剂。影响萃取的因素还有萃取温度、萃取压力、 夹带剂用量以及CO2 流量等，经实验确定在分离Ⅰ压力10 MPa，温度50 ℃，分离Ⅱ压力7 MPa，温度40 ℃，萃取时间2 h时，可保证胡椒碱提取分离完全。在保持投料量及分离条件一致的情况下，考察了萃取压力、萃取温度、夹带剂用量及CO2流量对萃取结果的影响。结果如图1～4。 
       3.2  胡椒碱SFE–CO2工艺的优化根据单因素的实验结果可知，胡椒碱的主要受萃取压力、温度及夹带剂用量的影响，为了筛选更适宜的萃取条件，选择了如表2所示的实验因素与水平，进行胡椒碱SFE–CO2工艺的优化。实验结果见表3，分析结果见表4。表2  正交实验因素水平（略）表3  正交实验结果（略）表4  方差分析（略）
       3.2.1  结果分析由方差分析可知，压力对胡椒碱含量有影响，温度有显著的影响，夹带剂用量无影响，根据结果，确定最佳工艺为A3B3C3。而压力对胡椒碱收率有显著的影响，温度和夹带剂用量因素也都有影响，根据结果，确定最佳工艺为A3B2C2。
         综合考虑，选择最佳提取工艺为A3B3C2，即萃取压力30MPa，温度60℃，夹带剂用量1∶0.5（w/v）为优化条件。
       3.2.2  验证实验称取干燥（50℃）至恒重的胡椒粗粉150 g，置于萃取釜中，重复二次最佳优化条件A3B3C2实验结果：胡椒碱含量平均为77.14％，胡椒碱提取率平均为 83.96％。
       3.3  胡椒碱溶剂提取工艺
       3.3.1  混合溶剂提取工艺考察（专利）［4］准确称取3份胡椒粉末各50 g，均加入100 ml乙醇∶醋酸乙酯＝2∶1的混合溶剂，40℃下浸提，1 h后抽滤，重复提取4次，合并提取液，减压浓缩至浸膏，HPLC法测定胡椒碱含量。结果见表5。
       3.3.2  乙醇提取工艺考察准确称取3份胡椒粉末各50 g，均加入300 ml 95%乙醇，回流提取2 h，抽滤，再向滤渣中加入200 ml95%乙醇，回流提取2 h，合并提取液，减压浓缩至浸膏，HPLC法测定胡椒碱含量。结果见表5。
       3.3.3  氯仿提取工艺考察准确称取3份胡椒粉末各50 g，均加入200 ml氯仿，回流2 h，抽滤，再分别向滤渣中加入100 ml氯仿，回流2 h，合并提取液，减压浓缩至浸膏，HPLC法测定胡椒碱含量。结果见表5。将超临界萃取工艺的萃取结果和常规溶剂提取的结果进行比较。结果见表5。表5  超临界萃取与溶剂回流提取考察数据（略）
       4  讨论
        
       胡椒碱作为最早从胡椒中分离出的一种生物碱，是胡椒中含量及活性最高的一种化学成分。目前，从胡椒中提取胡椒碱的方法主要是溶剂法，但常规的溶剂提取法得到的浸膏颜色呈深棕色，有明显的溶剂残留味。采用SFE-CO2得到的浸膏颜色较浅，为黄色，有胡椒的特征香气和强烈的辛辣味。而且溶剂用量少，提取时间短，浸膏中胡椒碱含量及胡椒碱收率均高于有机溶剂法。在萃取压力30 MPa，温度60℃，乙醇为夹带剂，用量为1∶0.5（W/V），CO2流量5.6 L/h，提取时间2 h的最佳条件下，萃取物中胡椒碱含量达到77％左右，物料中胡椒碱的收率可达83％左右。
        
       胡椒碱见光易分解，而超临界CO2萃取法在整个萃取过程是密闭的，因此有利于胡椒碱的稳定，超临界萃取技术在此方面体现出优越性。
        
       后续的研究实验表明，SFE-CO2可在低温、低压下先萃取胡椒油，然后升高温度和压力，萃取胡椒碱，该工艺操作简单、提取效率高而且生产成本降低，结果令人满意，因此，超临界CO2萃取方法提取胡椒中有效成分的工艺有着良好的工业化前景。
       【参考文献】
         　　［1］中国科学院中国植物志编辑委员会．中国植物志，第20卷，第一分册［M］．北京：科学出版社，1982：24．
       
       ［2］郑虎占，董泽宏，余 靖，等．中药现代研究与应用，第4卷［M］．北京：学苑出版社，1998：3243.
       
       ［3］刘文,孙宇章.胡椒中胡椒碱的提取工艺研究［J］.中国中药杂志,2003,28(5):456.
       
       ［4］林小明,施载峰,孙振范.胡椒油树脂制备方法［J］.PCN 1290730A,2001-4-11.