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       【摘要】 
       目的观察中药提取物青蒿琥酯（artemisunate，ART）对结肠癌细胞侵袭的作用，并探讨其可能机制。方法采用不同浓度的青蒿琥酯处理结肠癌SW620细胞，以软琼脂集落培养试验检测癌细胞锚着不依赖性增殖，以Boyden小室模型方法检测癌细胞侵袭能力，以Western blot方法检测细胞间黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)蛋白变化。结果青蒿琥酯能有效地抑制结肠癌细胞SW620的恶性增殖和侵袭能力，且呈剂量依赖性（P<0.01）。青蒿琥酯能有效地抑制癌细胞ICAM-1基因蛋白表达，呈时间和浓度依赖性（P<0.01）。结论青蒿琥酯可明显抑制结肠癌SW620细胞侵袭，其机制可能与下调ICAM-1蛋白水平有关。
       【关键词】  青蒿琥酯； 结肠肿瘤； 锚着不依赖性增殖； 细胞间黏附分子
       Inhibition of Artemisunate on Invasion of Human Colon Cancer Line SW620
       FAN Yu，ZHANG Youli，YAO Guangtao，LI Yikui
       （1.Deparment of Gastroenterology, Affiliated Hospital of Jiangsu University,Jiangsu Zhenjiang 212001，China；2.Experimental Center of Science and   Technology of Shanghai University of Traditional Chinese Medicine,Shanghai 201203，China）
       Abstract：ObjectiveTo study the effects and mechanism of Artemisunate on human colon cancer.MethodsAfter colon cancer SW620 cells were treated with different doses of Artemisunate, the growth of anchorage independence of cancer cells was studied in soft agar colony formation,and invasion ability was determined by Boyden chamber,and the protein level of intercellular adhesion molecule-1(ICAM-1) was detected by Western blot assay. ResultsArtemisunate could significantly inhibit both invasion ability and anchorage independence growth in a dose-dependent manner. The level of protein of ICAM-1 was down-regulated as compared with control group.ConclusionArtemisunate can inhibit invasion of colon carcinoma cell line SW620 through down-regulating ICAM-1 expression.
       Key words：Artemisunate；  Colon carcinoma；  Anchorage independence growth；  Intercellular adhesion molecule-1
       
       青蒿琥酯（artemisunate，ART）是中药青蒿提取物的衍生物，研究发现，ART具有重要的抗肿瘤作用［1］，但在胃肠道肿瘤细胞研究极少。细胞间黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)是体内重要的免疫活性分子，与肿瘤侵袭转移具有密切的关系［2，3］。为此，本研究采用ART处理结肠癌SW620细胞，观察了ART对结肠癌细胞锚着不依赖性增殖、侵袭和ICAM-1蛋白表达的影响，以探讨其抗癌机制。
       1  材料与方法
       1.1  材料  
       青蒿琥酯，广西桂林第二制药厂产品，用0.5%NaHCO3溶解后再用生理盐水配置成所需浓度。RPMI1640、新生小牛血清，购自GIBCO公司。人结肠癌细胞株SW620，浙江大学肿瘤研究所冻存。ICAM-1单克隆抗体购自Santa Cruz公司。
       1.2  细胞培养   
       人结肠癌SW620细胞在含15%新生小牛血清的RPMI1640液中培养，置37℃，50 ml/L CO2培养箱中。每日观察，待细胞至对数生长期，采用不同浓度的青蒿琥酯处理后，然后准备进行以下实验。
       1.3  软琼脂集落培养实验
       1.3.1  制备细胞悬液  
       将处理组及对照组细胞用含0.01%EDTA的0.25%胰酶消化，制备单细胞悬液，调整细胞浓度为2×103 细胞/ml，置室温备用。
       1.3.2  制备底层琼脂   
       将1%的琼脂凝胶于微波炉完全溶化后放置45℃水浴中，温度平衡后与等体积45℃预温的汉20%新生小牛血清的RPMI 1640培养液混匀，加入6孔板中，每孔4 ml，置超净台中室温放置，令其充分凝固。剩余的琼脂粉/培养基混合物置于42℃水浴中待用。
       1.3.3  制备上层琼脂取42℃保温的琼脂粉/培养基混合物1.2 ml与0.8 ml细胞悬液混合，迅速混匀，取1 ml铺于底层琼脂上，每个样品三复孔。同时做空白阴性对照及溶剂对照。置培养板于超净台室温待其充分凝固后，移入37℃，5%，CO2孵箱中培养14 d。
       1.3.4  计数倒置显微镜下随机计数每组样品10个视野中的集落数，取其平均数作比较。结果采用方差分析。
       1.4  体外侵袭抑制实验   
       该实验在改良的Boyden 小室中操作，根据文献方法［4］进行。Boyden小室的上下室之间隔以孔径为8 μm的聚碳酸酯膜，膜上铺匀1∶2稀释的基底膜胶（Matrigel）。下室加预先制备的NIH3T3细胞培养上清液作为趋化因子，上室加入50～800 μl待测的肿瘤细胞悬液。置于37℃，5%CO2培养箱中温育12 h，弃去上室液体，取出聚碳酸酯膜，用棉签仔细擦尽膜上Matrigel及未穿过的细胞，甲醛固定5 min，HE染色。400倍光镜下计数穿过聚碳酸酯膜的细胞数，以侵袭细胞的相对数目表示肿瘤细胞侵袭能力。随机计数5个视野内的细胞数，取平均值进行统计处理，每组计数3份样本。
       1.5 ICAM-1基因蛋白检测   
       按照上述时间收集各组细胞，提取细胞总蛋白，蛋白定量后进行常规Western blot 检测。利用Kodak Digital Science 1D Image Analysis Software （Eastman Kodak Company，USA）测定Western Blot条带净灰度值，并与内参照β-actin的测定结果相比较，计算其比值。
       1.6  统计学方法
       采用SPSS 8.0统计软件包进行统计学处理，所得到的数值均以±s表示。
       2  结果
       2.1  ART对结肠癌细胞软琼脂集落形成的影响 
       结肠癌SW620细胞在体外半固体培养体系中可以自发地形成集落。而细胞经青蒿琥酯处理后，所形成的集落数明显减少，且呈剂量依赖性（P<0.01）。见图1。
       2.2  ART对结肠癌细胞侵袭的影响
       收集经ART处理的细胞，采用Boyden小室检测癌细胞侵袭情况。结果发现，与对照组比较，ART处理组癌细胞穿过滤膜的细胞数明显下降，且呈浓度依赖性(P<0.01)。见图2。
       
       2.3  ART对结肠癌细胞ICAM-1基因表达的影响  
       本研究采用Western blot法检测ART对癌细胞ICAM-1蛋白水平的影响。结果发现，ART各个剂量组在作用细胞24 h后，ICAM-1蛋白表达就开始出现降低；随着作用时间的延长，ICAM-1蛋白降低更加明显，到72 h时非常显著。同时发现，ICAM-1蛋白水平降低与ART作用浓度密切相关。见图3。
       3 讨论
        正常真核细胞，除成熟血细胞外，大多须粘附于特定的细胞外基质上才能抑制凋亡而存活，称为锚着依赖性（anchorage dependence）。一般认为，肿瘤细胞在软琼脂形成集落的多少可反映肿瘤细胞锚着不依赖性增殖的特性，且与其恶性程度呈正相关。癌细胞侵袭能力强，则在软琼脂上形成的集落数目多。本研究发现，经不同浓度的青蒿琥酯处理的癌细胞软琼脂集落数明显受到抑制。说明，青蒿琥酯可在一定程度上抑制结肠癌细胞的侵袭能力。
       
       肿瘤细胞本身的运动能力和侵袭力在肿瘤转移过程中发挥重要作用，运动能力不仅是肿瘤细胞侵袭周围组织，而且是侵入血管和穿出血管所必须。从理论上讲，抑制肿瘤细胞运动将抑制肿瘤细胞的浸润和转移。一旦肿瘤细胞从原发肿瘤上脱落，它们将侵入宿主的细胞外基质,然后，穿透淋巴管和血管。为此，肿瘤细胞的侵袭必须穿透血管周围的细胞外基质。本研究所用的基质胶(matrigel)含有Ⅳ型胶原、层粘蛋白、巢蛋白(entactin)、硫酸肝素蛋白多糖等成分，与细胞外基质的成分非常相近。因此，能有效地在体外模拟肿瘤细胞的侵袭过程。在体外侵袭实验中，我们观察到SW620胞具有较强的侵袭及趋化能力。ART能使穿过聚碳酸脂膜的胃癌细胞数量减少，降低了结肠癌细胞的侵袭和趋化能力。
       
       肿瘤细胞的侵袭转移是一个复杂的过程。粘附是肿瘤细胞侵袭转移过程中的重要环节。粘附因子介导肿瘤细胞与细胞外基质、血管内皮细胞、靶器官细胞之间的相互作用，因此与肿瘤侵袭转移行为密切相关［1］。ICAM-1是一种跨膜蛋白，通过与其配体淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1，CD11a/CD18)和巨噬细胞相关复合体(Mac，CD11b/CD18)结合，介导细胞与细胞之间的相互活动；参与呈递抗原信息、激活细胞免疫等过程［4，5］。正常情况下，ICAM-1仅在血管内皮细胞等细胞低水平的表达，但在炎症、器官移植、肿瘤免疫等情况下表达量明显增多［6～8］。Natali等［9］研究发现ICAM-1表达水平与黑色素瘤瘤体厚度及临床病程有很高的相关性，ICAM-1高表达的肿瘤细胞侵袭转移能力高。有学者发现，与癌旁组织和结肠腺瘤组织比较，结肠癌组织中有ICAM-1过表达，这可能与结肠癌细胞能自分泌或刺激邻近组织旁分泌ICAM-1有关［10］。
       
       本研究采用ART处理癌细胞后，于不同时间收集细胞，采用Western blot检测ICAM-1蛋白表达。结果发现，ART能有效地可下调结肠癌细胞ICAM-1蛋白水平表达。随着ART的浓度增加，作用时间延长，SW620 细胞ICAM-1 蛋白表达水平逐渐降低。说明，ART抑制结肠癌细胞ICAM-1蛋白表达，呈浓度和时间依赖性。由此提示，ART能有效地抑制结肠癌细胞恶性侵袭，可能与抑制ICAM-1表达有关。
       【参考文献】
         　　［1］肖柳英，林培英，张丹，等. 青蒿琥酯对小鼠肝癌及S180实体瘤的抑制作用［J］.实用癌症杂志，2001，16(3)：245.
       
       ［2］王勤,吴理茂,李爱媛,等. 青蒿琥酯抗肝癌作用的实验研究［J］.中国中药杂志,2001, 26(10): 707.
       
       ［3］Lalani E L N, Laniado M E, Abel PD. Molecular and cellular biology of prostate cancer［J］.Cancer Metastasis Rev,1997,16(1):29.
       
       ［4］范钰，张尤历，许则丰. 青蒿琥酯抑制结肠癌SW620细胞侵袭的体外实验研究［J］.江苏大学学报医学版,2006,16(4)：298.
       
       ［5］Bessa X, Elizalde JI, Mitjans F, et al. Leukocyte recruitment in colon cancer: role of cell adhesion molecules, nitric oxide, and transforming growth factor beta1［J］.Gastroenterology,2002,122：1122.
       
       ［6］Banner BF, Savas L, Woda BA. Expression of adhesion molecules in the host response to colon carcinoma［J］.Ultrastruct Pathol,1995,19：113.
       
       ［7］Liu YZ, Chen B, She XD. A clinical evaluation of serum concentrations of intercellular adhesion molecule-1 in patients with gastric cancer［J］.World J Gastroenterol,1998，4：225.
       
       ［8］Sun JJ, Zhou XD, Zhou G, et al. Expression of intercellular adhesive molecule-1 in liver cancer tissues andliver cancer metastasis［J］.World J Gastroenterol,1998,4:202.
       
       ［9］Natali P G, Hamby C V, Felding-Habermann B, et al. Clinical significance of α v β3 integrin and intercellular adhesion molecule-1 expression in cutaneous malignant lesions［J］.Cancer Res,1997,57(15)：1554.
       
       ［10］杨明智, 王培戈, 陈积圣, 等. 大肠癌ICAM-1的表达及临床意义［J］.癌症，2001，20：311.