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       【摘要】 
       通过单因素和正交实验,以多糖得率为指标,确定山茱萸多糖的最佳提取工艺,同时对山茱萸多糖理化性质进行分析,结果表明，山茱萸多糖最佳水提工艺条件:温度80℃，料液比1∶60，时间5 h, 在此条件下山茱萸多糖得率是13.8%,经DEAE-52纤维素离子交换和SephadexG-200柱层析法得到组分S21, 经元素分析仪测定C%37.80%，H%5.64%，S%0.37%，N未检出。
       【关键词】  山茱萸多糖; 提取； 分离纯化； 理化性质
       中药山茱萸为山茱萸科植物山茱萸Cornus officinalis Sieb.et Zuce的干燥成熟果实，主要产于浙江、安徽、河南等地。其味酸涩，性微温，归肝肾经，具有补益肝肾，收敛固涩的作用。现代药理研究表明山茱萸果肉及果核中含有丰富的糖类和多种氨基酸、VitB1、VitB12等［1］。山茱萸多糖具有免疫调节活性及明显的抗氧化作用［2，3］随着我国社会经济文化的发展，人们的生活质量普遍提高，因此具有保健预防功能的山茱萸越来越引起国人的重视。本实验以多糖得率为指标，采用正交实验对山茱萸多糖的提取工艺进行优选，以期找出合理可行的制备工艺并研究分析其部分理化性质。
       1  器材和方法
       1.1  材料
       供试山茱萸干燥果实产于安徽,购于广州中医药大学大药房有限公司中药饮片厂，将山茱萸原料粉碎,置干燥器中备用。
       1.2 试剂
       浓硫酸，质量分数为6%的苯酚(分析纯重蒸馏试剂),质量分数为95%的乙醇,氯仿,正丁醇,葡萄糖, 氯化钠等,以上试剂均为分析纯。
       1.3  仪器
       核酸蛋白测定仪,德国Hettich公司；自动收样器,美国Whaters公司；AlphaI- 2 型真空冻干机,德国Christ公司；电热恒温水槽(DK8D型), 上海森信实验仪器有限公司；高速冷冻离心机,德国Hettich公司。
       1.4  方法
       1.4.1 粗多糖样品的制备
       山茱萸干粉,不同条件加热(搅拌)浸提,离心,上清液加热浓缩至体积的1/4,95%乙醇沉淀至75% (V/V)，4℃静置过夜, 离心,取沉淀,丙酮乙醚无水乙醇溶剂系统反复冲洗,真空冷冻干燥得到粗多糖样品。
       1.4.2 山茱萸多糖含量测定［4］
       采用苯酚-硫酸法, 以葡萄糖为标准单糖制作标准曲线，得回归方程为：Y=0.007 7X+0.025 7, R2=0.999 5 ［多糖的量（μg）为横坐标，光密度值为纵坐标］。 　　
       准确称取粗多糖样品6 mg,加蒸馏水至50 ml,配成120 μg/ml的样品溶液。吸取样品液1.0 ml，按标准曲线同法操作，测光密度，以标准曲线计算总糖含量。
       1.4.3 得率的计算山茱萸多糖得率(%)=山茱萸粗多糖样品中总糖含量(g)/山茱萸原料质量(g)×100%。
       1.4.4 单因素分析及正交实验
       本实验选取温度、时间、料液比、pH值这4个因素进行分析,并从中选取3个因素水平根据单因素分析结果, 采用L9(34)表做正交实验,以多糖提取率作为衡量提取效率的客观指标，以确定最佳提取工艺。
       1.4.5  山茱萸多糖的分离纯化
       按最佳提取工艺流程,将提取的红褐色山茱萸粗多糖(ZA)复溶于水, 用Sevag［5］法除蛋白,重复3次,加95%乙醇至30%,离心,得到粗多糖(ZB),上清液继续加95%乙醇至60%,4℃静置过夜, 丙酮-乙醚-无水乙醇溶剂系统反复冲洗,真空冷冻干燥,得到粗多糖样品(ZC)。称取样品AC 200 mg,溶于100 ml蒸馏水中,然后加到DEAE-cellulose-52离子交换柱洗脱(2.6 cm×26 cm)上,依次用蒸馏水及0.1，0.3，0.5，0.8，1.0 mol/L的NaCl水溶液洗脱,多功能电子蠕动泵控制流速为1 ml/min,用自动收集仪收集,苯酚-硫酸法跟踪检测多糖,合并各吸收峰的洗脱液,蒸馏水透析3 d，旋转蒸发仪浓缩,冷冻干燥,得到山茱萸多糖的两个分离产物S1 和S2。
       1.4.6 纯度测定
       凝胶色谱法:用0.05 mol/L NaCl溶液充分溶胀葡聚糖凝胶SephadexG200,超声脱气,搅拌均匀,沿玻璃棒小心缓慢地加入到柱中,同时用洗耳球敲击柱壁,使填料沉降均匀、紧密。柱型(2.6 cm×33 cm)，装柱完成后,用0.05 mol/L的NaCl溶液平衡48 h。称取经DEAE柱分离得到的多糖样品20 mg,溶于0.05 mol/L的NaCl溶液中,加入到SephadexG-200凝胶柱中,洗脱液控制流速为0.1 ml/min,用自动收集仪收集洗脱组分,2 ml/管,苯酚-硫酸法跟踪检测多糖,观察吸收峰形状,若峰对称,说明样品较纯,若峰形不对称,说明样品不纯,需要进一步分离纯化,方法同上。
       1.5  山茱萸多糖理化性质
       1.5.1  物理性质
       山茱萸多糖的颜色、形状、水溶性、有机溶剂的溶解性等。
       1.5.2  化学性质［6］
       Molish反应, 硫酸-苯酚反应, Fehling试剂反应, 碘-碘化钾反应，三氯化铁反应。
       1.5.3 蛋白含量测定考马斯亮蓝法: 以牛血清白蛋白制备标准蛋白质溶液，以OD595 值为纵坐标,蛋白的量为横坐标做标准曲线：Y=0.003 9X+0.003 2，R2 =0.999 3。 
       1.5.4  多糖基本元素分析
        
       通过CHNS/O元素分析仪来确定纯化后山茱萸多糖中基本元素的组成。
       2  结果
       2.1  山茱萸多糖提取条件的单因素分析
       2.1.1  乙醇添加量山茱萸多糖得率随乙醇添加量增加而增加,乙醇添加倍数达到3倍时，多糖沉淀完全,所以本研究以下的实验均选用3倍体积乙醇沉淀多糖。见图1。
       2.1.2  提取温度温度是影响多糖得率的重要因素。不同温度(40，50，60，70，80，90℃)对多糖得率产生影响:多糖得率随温度升高而升高,40～60℃升高较慢60～80℃较快,80℃达到最高值,因此确定正交实验温度3水平为60，70，80℃。 见图2。
       2.1.3  提取时间提取时间是影响多糖得率的另一个重要因素,不同时间(1，2，3，4，5，6 h )对多糖得率的影响如图3所示。多糖得率随时间升高而升高,1～3 h升高较慢,3～5 h升高较快,因此确定正交实验提取时间水平为3，4，5 h。见图3。
       2.1.4  加水量不同加水量(30，40，50，60，70，80倍)对多糖得率的影响如图4所示。多糖得率随加水量增加而增加。30～50倍水升高较慢,60～80倍水升高较快, 因此确定正交实验加水量的水平为60，70，80倍水。见图4。
       2.1.5  pH值不同pH值(1～7)对多糖得率的影响见图5。在酸性条件下多糖得率明显降低,pH>3时对多糖得率影响不大,可能在强酸环境下,多糖被降解,并且水提法成本低,所以酸提山茱萸多糖意义不大。
       2.2 正交实验
       根据以上的单因素实验分析,确定L9(34)表的3个因素温度、时间、料液比的3个水平。结果见表1。表1  正交实验的因素及水平（略）
        正交实验确定最佳提取条件。结果见表2。表2  正交设计及实验结果（略）
        由表2得知,3种因素对多糖得率的影响程度为A(温度)>B(时间)>C(加水量),水提法提取山茱萸多糖的优方案是A3B3C1。由表3方差分析和F检验得知,在95%可信程度下A和B对多糖得率的影响显著,C没有显著性影响,三者对本实验的影响程度与极差分析结果一致。表3  正交设计实验结果方差分析（略）
       2.3  山茱萸多糖的分离纯化按最佳提取工艺流程,提取的山茱萸粗多糖ZA,经Sevag法脱蛋白,由多糖得率看在脱蛋白过程中造成了多糖的同步损失,损失率在8%左右,可能和含有糖蛋白有关系。脱蛋白后经丙酮-乙醚-无水乙醇溶剂系统反复冲洗后,继续分级醇沉得到ZB和ZC,因预实验显示ZB抗氧化活性和免疫活性要明显小于ZC,因此将ZC 200 mg过DEAE-52纤维素离子交换柱,得到3个样品S15.2，S2118.6mg和S311.2 mg(S1和S3量少未做研究)。见图6。采用SephadexG-200对S2进一步纯化,洗脱曲线见图7。经浓缩,透析,冷冻干燥,得到进一步纯化的多糖样品S21。由图7看出S11为单一对称峰,说明其组分均一。
       2.4  山茱萸多糖理化性质分析
       ZA，ZC，S2和S21见表4经元素分析仪测定多糖S21中含C%37.80%，H%5.64%，S%0.37%，N未检出。表4  4种多糖理化性质（略）
       3  结论
        
        山茱萸多糖经单因素实验和L9(34)正交实验,得出其最佳提取工艺条件是:提取温度80℃，料液比1∶60，提取时间5 h,在此条件下山茱萸多糖得率是13.8%,经用Sevag法脱蛋白、丙酮-乙醚-无水乙醇溶剂系统反复冲洗、分级醇沉、DEAE-52纤维素离子交换柱层析法和SephadexG-200凝胶柱层析法对其进行分离纯化得到组分S21,经元素分析仪测定C%37.80%，H%5.64%，S%0.37%，N未检出。本实验对山茱萸多糖提取工艺,理化性质等进行了初步研究,为以后深入研究奠定了基础。
       【参考文献】
         　　［1］潘扬,王天山.植物山茱萸化学成分的研究概况［J］.南京中医药大学学报，1998,14(1)：61.
       
       ［2］魏淑梅,崔玉海.山茱萸多糖的分离纯化及活性研究［J］.黑龙江中医药,2006,19(4)：249.
       
       ［3］李平，王艳辉，马润宇.山茱萸多糖PFCAⅢ抗氧化性能研究［J］.北京化工大学学报，2003,30(3)：35.
       
       ［4］张维杰.复合多糖生化研究技术［M］.上海:上海科学技术出版社，1987：296.
       
       ［5］齐慧玲，魏绍云，王继伦，等.Sevag法去除白及多糖中蛋白的研究［J］.天津化工，2000,3：20.
       
       ［6］李建武,余瑞元，陈丽蓉，等.生物化学实验原理和方法［M］.北京：北京大学出版社，1994：125.