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       【摘要】 
       目的为黄精属部分药用植物建立聚类分析，对黄精属药用植物的分类进行研究。方法采用原植物鉴定、随机扩增多态性DNA（RAPD）、简单序列重复（ISSR）手段，对随机引物进行筛选，通过1.8%琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物。结果筛选23种RAPD引物，5种ISSR引物，经 PCR扩增产生足够的多态性谱带用于分析。结论采集不同产地的玉竹、小玉竹、多花黄精出现了一定程度的变异。RAPD，ISSR方法可以从分子水平区分黄精属药用植物。
       【关键词】  黄精属；聚类分析；RAPD；ISSR
       Studies on the Relationship of Some Species of Polygonatum by RAPD and ISSR
       ZHOU Ye,TANG Cheng,ZHANG Gong,LI Peifu,WANG Runling*
       (College of Pharmacology,Tianjin Medical University,Tianjin 300070,China)
       Abstract：ObjectiveTo establish the systematic cluster analysis for the relationship of the accessions of Polygonatum and give some information for the classification of plants which belong to Polygonature.Methods Identification of original plant, RAPD and ISSR were used. All of the samples were amplified by PCR system and separated by 1.8% electrophoresis. Results23 arbitrary premiers were evaluated for the analysis of RAPD, 5 arbitrary premiers were evaluated for the analysis of  ISSR, the primers could yield enough polymorphic bands for the analysis. ConclusionThe plants such as P. odoratum, P. humile and P. cyrtonema collected from different areas also have some difference. RAPD and ISSR can be used for the identification of Polygonatum in molecular level.
       Key words：Polygonatum;   Systemic cluster analysis；  RAPD；  ISSR
       
       黄精属在全世界约40种，我国有31种，分布于全国各地，尤以西南地区居多。2005版《中国药典》记载中药黄精为百合科植物滇黄精Polygonatum kongianum Coll.et Hemsl、黄精P. sibiricum Red.、多花黄精P. cyrtonema Hua.的干燥根茎。玉竹为百合科植物Polygonatum odoratum（Mill.）Druce的干燥根茎［1］。自1875年Baker将黄精属分为互生叶类Alternifolia、轮生叶类Verticillata、对生叶类Oppositifolia 3个类群之后，该属各种之间的关系至今仍存在争议，尚未见到较为全面的研究。Baker划分的这三个类群显然是不很合适的，过分地着重了叶序这个性状，从我国大量的材料来看，叶序这个性状并不十分稳定，在同一个种内都有变化［2］。Shian WU等［3］从形态学、细胞学、叶绿体DNA序列探讨了春水玉竹的位置，认为春水玉竹Polygonatum simizui Kitag.应从玉竹中划分出来，独立成种。临床使用中药黄精和玉竹时，也经常发现掺伪现象［4］ ，这与分类上的争议也有一定的关系。
       
       随机扩增多态性DNA技术(Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD)是20世纪90年代发展起来的分子标记技术，能客观地揭示供试材料间DNA的差异，操作简便、快速。简单序列重复(Inter-Simple Sequence Repeat，ISSR.)分子标记是Zietkiewicz E在1994年提出的技术。具无需知道任何靶标序列的微卫星背景信息、遗传多态性高、检测快速的特点，经实验证明是可靠、且可提供有关基因组丰富信息的DNA指纹技术。为了获得稳定性、重复性与清晰度均较好的谱带，本文综合以上两种方法，查阅大量文献，自行设计引物，筛选出特异性引物，结合原植物鉴定，探讨了玉竹、小玉竹、黄精、长梗黄精、多花黄精的亲缘关系。
       1  器材与方法
       1.1 试剂
       琼脂糖（Promega公司）、Taq酶、dNTP、引物、DL-2000、MgCl2、6×加样缓冲液、10×PCR缓冲液（宝生物公司）、溴化乙啶（EB）（Sigma公司）、三（羟甲基）氨基甲烷（Tris,天津市凯通化学试剂有限公司）、其它试剂为分析纯。CTAB提取液［2％（W/V）CTAB，100mM Tris-HCl, 20mM EDTA, 1.4M NaCl， 2％二巯基乙醇，pH8.0）。CTAB/NaCl溶液:（10％ CTAB ,0.7M NaCl）；CTAB沉淀液［1％（W/V）CTAB, 50mM Tris-HCl, 10mM EDTA, pH8.0 ］；高盐TE缓冲液［10mM Tris-HCl, 10mM EDTA, 1M NaCl, pH8.0］。
       1.2 仪器
       TGL-16G型台式高速离心机（上海医用分析仪器厂）；HH-42型快速恒温数显水箱 （常州国华电器有限公司）；UV-240 紫外分光光度仪（Shimadzu公司）；2400型PCR仪（GeneAmp公司）。凝胶电泳仪（DYY-Ⅲ33A型，北京市六一仪器厂）。
       1.3 材料
       采自天津、河北省、江西省和北京植物园等地。材料来源见表1。表1  材料来源（略）
       2  方法
       2.1  原植物鉴定本次采集的黄精属Polygonatum植物分种检索如下［2］。
       2.2  引物筛选及RAPD分析［5，6］
       选取GTTTCGCTCC，TGCTCTGCCC，TGCGCCCTTC等 23条随机引物，分别放入反应体系并按照下列比例，加入其它组分，其中模板DNA浓度为5ng/μl。
       
       RAPD扩增反应总体积为25.2 μl：5 μl 5 ng/μl模板DNA、2.5 μl 10 μM引物、2.5μl各为2.5 mM dNTPs、2.5 μl PCR缓冲液、3 μl 25 mM MgCl2、0.2 μl Taq酶、9.5 μl高压水，混匀，扩增。
       
       扩增程序： 第1阶段，预变性94℃，3 min；第2阶段，每个循环94℃变性1 min，37℃退火1 min，72℃延伸2 min，共40个循环；第3阶段，72℃继续延伸4 min，4℃储存。配制1.8%琼脂糖凝胶（含EB），在1×TAE缓冲液中电泳，电泳电压70 V，凝胶成像分析系统拍照，选取扩增效果较好的引物用作最终的分析。
       2.3 引物筛选及ISSR分析［7，8］
       ISSR标记扩增反应总体积为25.2 μl：7.5 μl 5 ng/μl模板DNA，1.25 μl 10 μmol/L引物，2.5 μl各2.5 mmol/L dNTPs，2.5 μl 25 mmol/L MgCl2 ,2.5 μl PCR缓冲液、0.2 μl Taq酶，8.75 μl高压水，混匀，扩增。
       
       第1阶段，预变性94℃，5min；第2阶段，每个循环94℃变性45 s，52.3℃退火60 s，72℃延伸90 s，共41个循环；第3阶段，72℃继续延伸7 min，4℃储存。配制1.8%琼脂糖凝胶（含EB），在1×TAE缓冲液中电泳，电泳电压为70V，用凝胶成像分析系统观察、拍照。引物 (AC)8T，(ATG)5，(CA)8G，(TC)8G，（AG）8T产生条带较好，可用于分析。
       3  结果
       3.1  RAPD分析结果
       电泳图谱中有带计为1，无带计为0。样本间的遗传相似性用遗传距离D衡量，其中Nx、Ny分别为样品x和样品y所显现的总条带数，Nxy为两个样本共有的条带数。D＝1-2Nxy/(Nx+Ny)。结果见表2～3。表2  通过RAPD法得到的各个样品的遗传距离（略）表3  通过RAPD法得到的不同产地玉竹的遗传距离（略）
       3.2 ISSR分析结果见表4～5。表4  通过ISSR标记法得到的各个样品的遗传距离（略）表5  通过ISSR法得到的不同产地玉竹的遗传距离（略）
       4 讨论
        RAPD结果产生的多态性条带虽较多，但存在稳定性、重现性差的缺点。相对于RAPD法，ISSR法所选引物产生多态带数目较少，但重复性远比RAPD好。这是因为该方法的退火温度较高，且本实验应用梯度PCR仪，如PTC-200型梯度PCR仪能达到的最低温度为42℃，采用ISSR标记法有利于选择恰当的退火温度，同时避免了温度过低引起的非特异性扩增反应，提高了整体反应的重复性。
        玉竹与黄精的遗传距离比较近，在0.222～0.368之间。虽然玉竹与小玉竹均具有互生叶序，但也存在一定差异、遗传距离较远。它们的遗传距离在0.227～0.579之间。本次从不同产地采集的小玉竹、多花黄精出现了一定程度的变异，其遗传距离较大，为鉴定不同产地的同种药材奠定了基础。
       
       从天津城郊的八仙山、九山顶地区，河北省的雾灵山区，江西省九江山区，这4个采样点所采集的玉竹已经发生了一定程度的变异，可能由于各采样点的气候，土壤等条件不同，使之发生了一定程度的变异。揭示了长期在不同环境中生长造成其遗传特征发生的某些变化。人们可通过所选引物扩增产生的多态性条带对不同产地玉竹的道地性进行更深一步研究。通过ISSR标记分析也可以考察玉竹的遗传关系，其结论与RAPD的结论相近，但数值略小于RAPD，可能是由于ISSR标记法本身的退火温度较高所致，尚需进一步增加引物的数量来探讨。
       【参考文献】
         　　［1］国家药典委员会.中国药典，2005年版，Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社，2005：215.
       
       ［2］中国科学院植物研究所.中国植物志(第15卷)［M］.北京：科学出版社，1978：52.
       
       ［3］Wu S A, Yang J, Rao GY. Systematic position of Polygonatum simizui based on morphological, cytological and chloroplast DNA sequence data［J］. Botanical Journal of Linnean Society, 2001，137：291.
       
       ［4］郭凤翔，田连地. 黄精与玉竹不能混用［J］. 中国误诊学杂志，2002,11(11):1746.
       
       ［5］Doyle J. J, Doyle J. L. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue［J］. Phytochem Bull, 1987，19：11.
       
       ［6］F.M. 奥斯伯. 精编分子生物学技术实验指南，第1版［M］. 北京，科学出版社，2005：651.
       
       ［7］Martins. M, Sarmento. D, Oliveira. MM, et al.Genetic stability of micropropagated almond plantlets, as assessed by RAPD and ISSR markers［J］. Plant Cell Reports, 2004,23(7):492.
       
       ［8］Meloni M, Perini D, Filigheddu R，et al. Genetic variation in five Mediterranean populations of Juniperus phoenicea as revealed by inter-simple sequence repeat (ISSR) markers［J］. Annals of Botany, 2006,97(2)：299.