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       【摘要】 
       目的探讨提取方法、提取溶剂对小青龙汤复方提取的影响，并筛选出最佳提取工艺。方法拟用回流、渗漉两种传统提取法，水、60%乙醇、95%乙醇3种提取溶剂进行正交实验，以提取液中盐酸麻黄碱、芍药苷含量（权重系数依次为0.6，0.4）为指标，通过指标加权计算综合评分以评价提取工艺，筛选出6种不同提取工艺的最佳提取条件，再对这6种提取工艺进行相同方法不同溶剂、相同溶剂不同方法的比较研究。结果小青龙汤最佳提取工艺为以12倍量60%乙醇回流提取2次，1.5 h/次。结论所得优化提取工艺合理可行，可作为小青龙汤的提取工艺。
       【关键词】  小青龙汤复方；正交实验；盐酸麻黄碱；芍药苷
       Study on the Optimal Extraction of Xiaoqinglong Tang
       LAI Qingkuan, YIN Rongli, YANG Zongkun,LI Shijuan, LIAO Fang, LI Ying
       （Chengdu University of TCM, Chengdu, Sichuan 611130,China）
       Abstract：ObjectiveTo optimize the extraction method of Xiaoqinglong Tang.MethodsThe refluxing-extraction method and percoaltion-extraction method were studied with water, 60% ethanol and 95% ethanol as the three different solvents ,orthogonal design was used according to orthogonal layout L9(34). The best extraction method was determined with the contents of the Hydrochloric acid ephedrine and peoniflorin(weight coefficients were 0.6,0.4 respectively) as indexes from six extraction methods.At last, the different solvents and methods were compared.ResultsThe best extraction  method was Refluxing-extraction method that was adding twelve times amount of 60% Ethanol and refluxing -extracting for 1.5h(totally extracting for 2 times).ConclusionThe best extraction method is stable and reliable.
       Key words:XiaoQingLong Tang prescription;  Orthogonal design;  Hydrochloric acid ephedrine；   Peoniflorin
       
       小青龙汤由麻黄、芍药、细辛、干姜、甘草、桂枝、半夏和五味子8味药组成，系张仲景所创辛温解表的代表方剂，主治风寒束表、水饮内停之证，具有解表化饮、止咳平喘之功效，疗效确切［1］。目前它的改进剂型有《中国药典》2005版收载的合剂与颗粒，但立足于复方汤剂整体性的提取工艺系统化研究尚未见报道。为进一步开发本复方，有必要从汤剂本身的系统性出发，对小青龙汤复方进行整体提取工艺的比较研究，得出稳定、可靠的提取方法及工艺条件，为小青龙汤复方制剂工艺改革提供依据。
       1  仪器与试药
       1.1  仪器Agilent 1100 Series 高效液相色谱仪（安捷伦公司）；Sartorius BP211-D电子天平（德国赛多利斯公司）。
       1.2  试药
       麻黄、芍药、细辛、干姜、甘草、桂枝、半夏和五味子药材（均购于成都市荷花池中药材市场）；磷酸二氢钾、磷酸；甲醇和乙腈为色谱纯。
       2  方法［2，3］
       2.1  指标及含量测定方法《中国药典》2005版收载的小青龙汤现有制剂均只以方中的芍药苷为质量控制指标，因此本方保留该质量控制指标。复方中麻黄为君药，因此增加盐酸麻黄碱为质量控制指标。
       2.1.1  盐酸麻黄碱含量测定方法盐酸麻黄碱对照品溶液的制备：精密称取盐酸麻黄碱对照品10.83 mg于100 ml容量瓶中，以甲醇定容，摇匀，精密吸取2 ml于25 ml量瓶中，甲醇定容，摇匀，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液备用。
       
       麻黄供试品的制备：精密量取复方提取液适量（相当于麻黄生药0.2 g）于已干燥的锥形瓶中，低温挥干，以25 ml甲醇溶解，称定重量，超声处理45 min，放冷，再称定重量，以甲醇补足减少量，摇匀，滤过，精密量取续液1 ml，置中性氧化铝柱（100～200目，内径1 cm，1.5 g）上，以50%甲醇洗脱，收集洗脱液约9 ml于量瓶中，加磷酸1滴，以50%甲醇定容摇匀，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液备用。
       
       测定方法：C18柱（250 mm×4.6 mm Diamonsil 5μm），流动相为乙腈-0.1%磷酸（9∶90），以三乙胺调节pH=4.5，检测波长207 nm，流速1 ml/min，柱温25℃，理论板数以盐酸麻黄碱峰计，不得低于3 000。
       
       盐酸麻黄碱标准曲线的绘制：分别吸取盐酸麻黄碱对照品溶液2，4，6，8，10，12，16，20，24 μl进样，按照测定方法测定，绘制标准曲线。结果见图1。回归曲线Y=1 722.7X+39.103，R2=0.999 8，盐酸麻黄碱进样量在0.017 288～0.207 456 μg间具有良好的线性关系。
       2.1.2  芍药苷含量测定方法
        芍药苷对照品溶液的制备：精密称取芍药苷对照品适量，加入量瓶中，甲醇定容，制成60 μg/ml的甲醇对照品溶液，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液备用。
       
       白芍供试品溶液的制备：精密量取复方提取液适量（相当于白芍生药0.1 g），水浴挥干，以35 ml稀乙醇转移至50 ml量瓶中，超声处理30 min，冷却至室温，稀乙醇定容，摇匀，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液备用。
       
       测定方法：C18柱（250 mm×4.6 mm,Diamonsil 5 μm），流动相为乙腈-0.1%磷酸（14∶86），检测波长230 nm，流速1 ml/min，柱温25℃，理论板数以芍药苷峰计，不得低于2 000。
        芍药苷标准曲线的绘制：分别吸取芍药苷对照品溶液1，2，3，4，6，8 μl进样，按照测定方法测定，绘制标准曲线，（见图2）。回归曲线Y=15 414X+2.539 1，R2=0.999 8，芍药苷进样量在0.006～0.048 μg间具有良好的线性关系。
       2.2  6种提取工艺的优化研究及结果
       2.2.1  不同提取溶剂回流提取工艺研究及结果以水、60%乙醇、95%乙醇为提取溶剂，按L9（34）正交表进行实验。因素水平安排按照表1执行，实验按各正交表实施，结果用SPSS11.5作方差分析，确定优化工艺。结果见表2～7。表1  不同溶液回流提取工艺因素水平（略）表2  以水为溶剂回流提取考察结果（略）表3  以水为溶剂回流提取方差分析结果（略）表4  以60%乙醇为溶剂回流提取考察结果（略）表5  以60%乙醇溶剂回流提取方差分析结果（略）表6  以95%乙醇为溶剂回流提取考察结果（略）表7  以95%乙醇为溶剂回流提取方差分析结果（略）
        由方差分析结果分析得，影响因素大小为：提取次数（C）＞提取溶剂量（A）＞提取时间（B），3个因素均具有显著性影响，优化工艺为A2B2C3。
       
        由方差分析结果得，影响因素大小为：提取时间（B）＞提取溶剂量（A）＞提取次数（C），3个因素均具有显著性影响，优化工艺为A3B2C2。
        由方差分析结果分析得，影响因素大小为：提取次数（C）＞提取溶剂量（A）＞提取时间（B），3个因素均具有显著性影响，优化工艺为A3B2C3。
       2.2.2 不同提取溶剂渗漉提取工艺研究及结果以水、60%乙醇、95%乙醇为提取溶剂，按L9（34）正交表进行实验。因素水平安排按照表8执行，实验按各正交表实施，结果用SPSS11.5作方差分析，确定优化工艺。结果见表9～14。表8  不同溶剂渗漉提取工艺因素水平（略）表9  以水为溶剂渗漉提取考察结果（略）表10  以水为溶剂渗漉提取方差分析结果（略）表11  以60%乙醇为溶剂渗漉提取考察结果（略）表12  以60%乙醇溶剂渗漉提取方差分析结果（略）表13  以95%乙醇为溶剂渗漉提取考察结果（略）表14  以95%乙醇为溶剂渗漉提取方差分析结果（略）
        由方差分析结果分析得，影响因素大小为：渗漉液量（A）＞渗液速度（C）＞药材粒度（B），A和C因素具有显著性影响，优化工艺为A3B2C3。
        由方差分析结果得，影响因素大小为：药材粒度（B）＞渗漉液量（A）＞渗漉速度（C），B因素具有显著性影响，优化工艺为A1B3C1。
        由方差分析结果分析得，影响因素大小为：渗漉液量（A）＞药材粒度（B）＞渗漉速度（C），A因素具有显著性影响，优化工艺为A2B2C1。
       2.3  不同提取工艺及提取溶剂对提取工艺的影响对比研究
       2.3.1  不同正交实验因素分析结果见表15。表15  不同正交实验结果分析（略）
       2.3.2 不同优化提取工艺的对比研究按照上述各种优化工艺，分别称取复方药材进行提取试验，以提取液中盐酸麻黄碱和芍药苷的含量为指标加权（权重系数依次为0.6和0.4），综合评价提取工艺。对比不同提取工艺的差异。结果见表16。表16  不同工艺验证结果(略)
       2.3.3  相同方法不同溶剂对提取工艺的影响研究结果见表17。表17  不同溶剂时间的比较结果（略）
       2.3.4  相同溶剂不同提取方法间的比较研究结果见表18。表18  不同提取方法比较结果（略）
       2.3.5  综合评价结果实验表明，在考察范围内，小青龙汤提取工艺优劣顺序为60%乙醇回流提取＞水回流提取＞60%乙醇渗漉＞95%乙醇回流提取＞水渗漉；提取方法对比研究结果表明，回流提取方法效果较渗漉提取方法效果好；提取溶剂对比研究表明60%乙醇为提取溶剂较其他两种溶剂效果好。
       3 讨论
        现有小青龙汤成方制剂只选择了芍药苷为含量控制指标，对于复方制剂的多指标多成分而言，显得质量控制过于单一。本研究从处方构成出发，增加君药麻黄的指标成分盐酸麻黄碱为指标，更多的注重全方的系统性。
        实验结果均反应回流提取法较渗漉法的提取效果好，其中提取溶剂又以60%乙醇为佳，这与控制指标的选择有一定的关系，但是是否在药效方面有正变的关系，还需要进行药效学研究。
        小青龙汤整体提取的不同工艺比较结果得出，优化提取工艺为12倍量60%乙醇回流提取2次，1.5 h/次。所得优化提取工艺合理可行，可作为小青龙汤的提取工艺。
       【参考文献】
         　　［1］段富津.方剂学［M］.上海：上海科学技术出版社，2002：25.
       
       ［2］国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社，2005.
       
       ［3］马云淑，宁朝香.小青龙滴丸的制备工艺及质量标准［J］.云南中医学院学报，1999，22（3）：14.