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       【摘要】 
       目的探讨玄参对心室重构大鼠血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）及其1型受体基因表达（AT1AmRNA)的影响。方法采用甲状腺素致大鼠心室重构及腹主动脉不完全结扎致大鼠心室重构两种动物模型，观察玄参对心脏指数（heart weight index，HWI）、心肌血管紧张素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）、醛固酮（aldosterone，ALD）及血管紧张素Ⅱ受体1型基因（AT1A mRNA）表达水平的影响。结果与模型组相比，玄参可显著降低动物HWI，降低心肌AngⅡ，ALD含量，降低AT1A mRNA的过量表达。结论玄参对心室重构具有明显的改善作用，其机制可能与抑制AngⅡ，ALD生成和AT1A mRNA表达有关。
       【关键词】  玄参； 心室重构； 血管紧张素Ⅱ； 血管紧张素Ⅱ1型受体； 基因表达
       The Influence of Xuanshen on the Concentration of AngⅡ and the Expression of AT1A mRNA in Ventricular Remodeling Rats
       GU Weiliang, CHEN Changxun*, WANG Ying
       (Dept. of Pharmacology,Shanghai University of Traditional Chinese Medicine,Shanghai 201203, China)
       Abstract：ObjectiveTo investigate the influence of Xuanshen on the concentration of angiotensin Ⅱ (AngⅡ) and the expression of angiotesin Ⅱ receptor (Type 1A) mRNA (AT1A mRNA) in ventricular remodeling rats.MethodsTwo ventricular remodeling models were established. One was induced by thyroxin and the other was induced by abdominal aortic stenosis in rats. The heart weight index (HWI), the AngⅡ and ALD concentration, and the AT1A mRNA expression were determined after a period of Xuanshen administration. ResultsCompared with those of ventricular remodeling rats, the HWI, the concentration of AngⅡ and ALD and the expression of AT1A mRNA were decreased in groups treated with Xuanshen. ConclusionXuanshen has an obviously effect on preventive ventricular remodeling. The mechanism may be related to the decline of AngⅡ and ALD concentration and the inhibition of AT1AmRNA expression.
       Key words：Xuanshen;  Ventricular remodeling;  AngⅡ;  AT1AmRNA;  Gene expression
        心室重构（Ventricular Remodeling）涉及心肌肥大、心肌重量增加、心腔容积增大、心室形状改变和心肌间质纤维化［1］。对各种心室重构动物模型的研究发现，心室重构并非是一种生理性的、良性的、适应性的代偿过程，而是一种可导致心功能严重损害的病变过程。因此在心室重构的初期即进行有效的干预意义重大。
        神经内分泌因子是心室重构发生与发展的重要因素，其中血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）是公认的核心因子，且AngⅡ随着心力衰竭的进展而升高［2］。因此寻找对AngⅡ过度激活有抑制作用的药物，对防治心室重构具有重要的现实意义。
        玄参为玄参科多年生草本植物玄参的根，是著名的传统中药。始载于《神农本草经》，列为中品，性寒,味苦、甘、咸，可入肺经、胃经、肾经，具有滋阴、降火、生津、凉血、解毒等功效。现代药理研究发现玄参在心血管系统具有广泛而重要的药理作用，而玄参抗心室重构的实验研究尚未见报道。
        本实验采用甲状腺素致大鼠心室重构和腹主动脉缩窄致大鼠心室重构两种动物模型,并以血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）及其1型受体基因表达（AT1AmRNA)为切入点，观察玄参对心室重构大鼠血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）及其1型受体基因表达（AT1AmRNA)的影响，并阐明其可能的抗心室重构的作用机制。
       1  器材与方法
       1.1  动物SD大鼠，雄性，体重220～250 g，购于中科院上海实验动物中心，合格证号 SCXK（沪）2003－0003，饲养于上海中医药大学实验动物中心SPF级动物实验室。
       1.2  仪器DL-50RC-L离心机（上海中科生物医学高科技开发有限公司）；SN-682放射免疫γ计数器（中国科学院上海原子核研究所日环仪器厂）；FJ－200高速分散均质机（上海标本模型厂）；754型紫外可见分光光度计（上海第三分析仪器厂）；PCR仪（ABI美国应用生物有限公司，型号：PCR SYSTERM 9700）；电泳仪（复旦科技，型号：FR-250）；凝胶成像（上海天能科技有限公司，型号：Tanon2500）；Biohit移液枪、Eppendorf移液枪。
       1.3  药品试剂 
       玄参（批号：060913），产地浙江，上海养和堂中药饮片有限公司；L-甲状腺素（L-Thy）（产品批号：1131479），Sigma公司；卡托普利（批号：060804），上海衡山药业有限公司；血管紧张素Ⅱ试剂盒（批号：20061230），北京北方生物技术研究所；考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒（批号：20070104），南京建成试剂公司；醛固酮放免试剂盒（批号：061220），北京北方生物技术研究所；2 × PCR MasterMix（批号： 2007040822），上海欣百诺生物科技有限公司；RevertAidtTM First Strand cDNA Synthesis Kit ,K1622 （批号：00022047），Fermentas公司，上海中晶代理。
       1.4  玄参药液制备玄参用8倍量水煎煮3次，每次微沸30 min，合并滤液浓缩，冷藏备用。实验用量按每千克给予的生药量计算。
       1.5  模型制备及分组给药
       1.5.1  抗L-甲状腺素致大鼠心室重构观察选用220～250 g的雄性SD大鼠50只，随机分为5组，每组10只，分别为：正常组、模型组、卡托普利组、玄参小剂量组和玄参大剂量组。除正常组外，各组连续7 d腹腔注射L-甲状腺素 0.25 mg·kg-1·d-1，1次/d，造成心室重构模型；正常组腹腔注射等量生理盐水。各给药组在给予L-甲状腺素后灌胃给予卡托普利40 mg·kg-1或玄参水煎液13.5，27 g·kg-1；正常组、模型组灌胃给予等量蒸馏水。连续灌胃给药9 d后，于处理前禁食不禁水12 h，然后取血和心肌进行各项分析。
        大鼠心肌肥厚指数的测定：大鼠称体重（BW）后腹主动脉取血。快速打开胸腔取心脏，去除心房组织，分离左、右心室，生理盐水漂洗去血，用滤纸吸干表面水分，电子天平准确称取左心室重量和全心重量。计算左心室重量/体重（LVW/BW）、全心重量/体重（HW/BW），分别记为左心室肥厚指数(LVWI)、全心肥厚指数(HWI)。
        心肌组织AngⅡ含量测定：取大鼠的心肌组织约200 mg,加入2 ml生理盐水在冰浴环境中快速匀浆，3 500 r·min-1离心10 min，取上清200 μl加生理盐水800 μl，制备成2%的心肌组织匀浆，按血管紧张素Ⅱ试剂盒说明书及考马斯亮蓝蛋白测试盒说明书进行操作测定AngⅡ及蛋白浓度。结果以每毫克蛋白中的AngⅡ含量表示。
       1.5.2  抗腹主动脉缩窄致大鼠心室重构观察大鼠用戊巴比妥钠30 mg/kg腹腔注射麻醉，仰位固定，打开腹腔，钝性分离腹主动脉，用内径为0.5 mm的银夹不完全结扎左右肾动脉之间的腹主动脉，使之外径狭窄至0.5 mm，制备压力超负荷性心室重构模型。假手术组动物仅分离腹主动脉后不做结扎。术后肌肉注射青霉素1×104U·kg-1·d-1 ,共3 d,预防感染。
       
       造模后2周手术组大鼠随机分组，每组10只。给药1次/d，连续给药8周。玄参小剂量组灌胃给予玄参水煎液13.5 g·kg-1；玄参大剂量组灌胃给予玄参水煎液27 g·kg-1；卡托普利组灌胃给予卡托普利水溶液40 mg·kg-1；假手术组和模型组大鼠灌胃给予等量蒸馏水。
       
       心脏指数：给药8周后，动物称重，颈动脉取血处死后，快速打开胸腔，分离心脏称重如前“大鼠心肌肥厚指数的测定”项下所述。
       
       心肌组织AngⅡ含量测定:取大鼠的心肌组织测AngⅡ含量，步骤如前“心肌组织AngⅡ含量测定”项下所述。
        血清醛固酮（ALD）含量测定：取血，静置1 h后，3 500 r/min离心10 min取上清液，按醛固酮试剂盒说明书进行操作。
        心肌组织AngⅡ受体1型基因（AT1A mRNA）的表达水平观察：提取总RNA及逆转录反应:每组取5个心肌标本，每个约100 mg，Trizol试剂盒提取总RNA，取2 μg总RNA逆转录合成cDNA ，－20 ℃保存。所有引物均由上海生物工程技术有限公司合成。表1  β-actin，AT1A引物序列（略）
        PCR反应：以稀释10倍后的cDNA为模板，用目的基因引物进行PCR反应，同时设β-actin作为内参，并根据实测的基因的mRNA丰度建立最佳循环数，优化反应条件。在冰上配制如下反应体系。见表2。表2  PCR反应体系配制表（略）
        配制完毕，放入PCR仪中进行如下反应：95℃预变性5 min； 进行29个循环：95℃变性30 s；55℃退火30 s；72℃延伸40 s；72℃最后延伸10 min。
        琼脂糖凝胶电泳检测：配制1.5%的琼脂糖凝胶，PCR产物3 μl，上样缓冲液2 μl，120V电压电泳30 min。用凝胶分析软件Tanon2500，根据条带强度进行积分计算分析读取数据，以AT1A /β-actin作为心肌组织AT1AmRNA表达的半定量指标。
       1.6  统计学处理实验数据以±s表示,采用Excel 统计软件进行t检验, 用直线回归分析双变量相关性。以P< 0.05，P<0.01分别表示统计学意义显著和非常显著。
       2  结果
       2.1  玄参对L-甲状腺素致大鼠心室重构的影响
       2.1.1  对心脏指数的影响模型组LVWI，HWI分别比正常组显著性升高（P<0.01）；在腹腔注射L-甲状腺素的同时，玄参大剂量组和卡托普利组灌胃9 d后， LVWI和HWI与模型组相比显著降低（P<0.01）。玄参小剂量组的LVWI、HWI与模型组比较无显著性差异（P>0.05）。结果见表3。
       2.1.2  对心肌组织AngⅡ含量的影响与正常组动物相比，模型组动物心肌组织中的AngⅡ含量显著性升高（P<0.01），玄参大剂量组和卡托普利组灌胃9 d后，与模型组比较左心室心肌组织中AngⅡ的含量显著降低（P<0.01）；玄参小剂量组左心室心肌组织中AngⅡ与模型组比较无显著性差异（P>0.05）。结果见表3。表3  玄参对L-甲状腺素致大鼠心室重构的影响 (略)
       2.2  玄参对腹主动脉缩窄致大鼠心室重构的影响
       2.2.1 对心脏指数的影响与假手术组比较，模型组心脏指数显著增加（P<0.01）。与模型组比较，玄参大剂量组和卡托普利组心脏指数显著性降低（P<0.05或P<0.01），玄参小剂量组心脏指数虽有下降，但差异不显著（P>0.05）。结果见表4。
       2.2.2  对醛固酮（ALD）、血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）含量的影响与假手术组比较，模型组ALD、AngⅡ含量显著增加（P<0.01）。与模型组比较，玄参小、大剂量组、卡托普利组均能显著性降低其含量（P<0.01）。结果见表4。表4  玄参对腹主动脉缩窄致大鼠心室重构的影响 (略)
       2.2.3  对心肌组织AT1A mRNA表达水平的影响AT1A mRNA电泳图(图1)经分析统计后的结果如表5所示：与假手术组比较，模型组AT1A mRNA含量显著增加（P<0.01）。与模型组比较，玄参小、大剂量组、卡托普利组AT1A mRNA含量显著降低（P<0.01）。表5  玄参对腹主动脉缩窄大鼠AT1A mRNA表达的影响(略)
       2.3  各指标间相关性分析结果见表6。表6  各指标间相关性分析（略）
       3 讨论
        心脏指数是一项病理学指标，是反映左心功能不全程度较为准确的指标，所以采用动物心室重构模型时，可用心脏指数来评价左心功能不全的严重程度［3］。本实验结果揭示玄参水提液能显著降低两种模型动物左心和全心指数增加，对防治心室重构意义明显。
        AngⅡ具有较强的致心肌纤维化的作用，它可以通过AT1受体的介导直接作用于心脏成纤维细胞引起胶原合成的增加［4］，促进心室重构，加速心力衰竭。AT1是一个含有7个跨膜肽链的膜蛋白，可通过G蛋白耦联途径介导AngⅡ的作用［5］。AT1亚型又进一步分为AT1A和AT1B，其中AT1A占90%左右，是AngⅡ作用于心血管系统的主要受体亚型［6］。
       
       本实验观察到甲状腺素致心室重构大鼠的AngⅡ与其左心指数呈明显正相关（r=0.97)。玄参水提液明显降低心脏指数，降低AngⅡ含量，其作用机制可能与其直接抑制AngⅡ的生成有关。
       
       腹主动脉缩窄所致心室重构大鼠的心肌AngⅡ浓度与其左心指数虽无明显相关性（r=0.26)，但AT1A mRNA表达与左心指数相关性较明显（r=0.82)，玄参水提液明显降低腹主动脉缩窄所致心室重构大鼠的心脏指数、AT1A mRNA表达和心肌AngⅡ浓度，其作用机制可能与其降低AT1A mRNA表达，间接阻断AngⅡ对心脏的作用有关，从而达到防治心室重构的目的。
        Rombousts等［7］认为ALD可能通过上调AngⅡ1型受体(AT1)的表达，使AngⅡ促进心脏成纤维细胞胶原合成的效应得以增强。另有证据显示ALD增加了血管内血管紧张素转化酶（ACE)的表达，从而导致AngⅡ的含量增加［8］。本次实验观察到ALD与AngⅡ（r=0.97)，及AT1A mRNA（r=0.87）均呈明显的相关性，证实了上述说法。玄参可明显降低ALD含量，这可能也是其抑制AngⅡ含量增加从而防治心室重构的作用机制之一。
       
       玄参抗心室重构的作用值得进一步研究，其作用机制还有待进一步地阐明。
       【参考文献】
         　　［1］张世春，马春华．充血性心衰治疗新进展［J］.四川生理科学杂志，2000，22(1):7.
       
       ［2］Serneri GG, Boddi M, Cecioni I, et al. Cardiac angiotensinⅡformation in the clinical course of heart failure and its relationsh ip with left ventricular function［J］.Circ Res, 2001, 88 (9) : 961.
       
       ［3］陈茂,范忠才，饶 莉，等.心脏重量指数评价左心功能不全价值的研究［J］.四川医学,2005，5(26):483.
       
       ［4］Shen Jingping, Li Ruifeng. The Responseness of the Fibroblasts from the Myocardium-Infracted Rats to AngiotensinⅡ［J］.Chin J Arterioscler, 2002,10(2):115.
       
       ［5］Suzuki J,M atsubara H,U rakam iM,et al Rat angiotesin Ⅱ(Type 1A) receptor mRNA regulation and subtype expression in myocardial growth and hypertrophy［J］. Circ Res,1993,73:439.
       
       ［6］杨丽霞.心脏血管紧张素Ⅱ受体研究进展［J］.心血管病学进展，2003，24（2）：81.
       
       ［7］Rombousts K,Niki T,Wielant A,et al. Influence of aldosterone on collagen synthesis and proliferation of rat cantiac fibroblasts［J］.Br J Pharmacol,2001.134(2):224.
       
       ［8］Macdonald JE,Kennedy N ,Struthers AD. Effects of spironolactone on endothelial function, vascular angiotensin converting enzyme activity, and other prognostic markers in patients with mild heart failure already taking optimal treatment［J］.Heart，2004, 90:765.