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       【摘要】 
       目的优选二氧化碳超临界流体（CO2-SFE）萃取茯苓多糖工艺参数。方法以茯苓多糖为评价指标，采用正交实验法对CO2-SFE萃取茯苓多糖提取工艺进行优选。结果最佳提取工艺条件为：温度35℃，压强20 MPa，夹带剂（水）用量0.4 ml/g，萃取4.0 h。结论优选出的工艺科学合理。
       
       【关键词】  茯苓； 正交实验法； 二氧化碳超临界流体萃取
       Orthogonal Test for Optimization of CO2-SFE Process of Pachyman in Poria cocos(Schw.) Wolf
       ZHAO Zijian, LIAN Yan， WANG Guoquan， LI Wanwei
       (1.Chemical Department, Huaihua University, Huaihua, Hunan 418008，China； 2.Shanxi Traditional Chinese Mediccal College, Xianyang, Shanxi 712046，China)
       Abstract：ObjectiveTo optimize the CO2-SFE process of pachyman in Poria cocos(Schw.) wolf. MethodsThe orthogonal test was used to optimize CO2-SFE process of pachyman in poriacocos(Schw.) wolf with the rate of pachyman in poriacocos(Schw.) wolf as index. ResultsThe optimal extraction procedure was as follows: the extraction temperature was 35℃, the extraction pressure was 20 MPa, the content of chemical preparation was 0.4 ml/g and the extraction time was 40 h. ConclusionThe optimum extraction procedure is reasonable and stable.
       Key words：Poria cocos(Schw.)Wolf.；  Orthogonal test；  Supercritical fluid extraction
       
       茯苓，别名茯菟、松腴、不死面、松薯［1］，为多孔菌科真菌茯苓Poriacocos(Schw.)Wolf.的干燥菌核，其味甘、淡，性平，能健脾利湿，益智安神，其主要有效成分茯苓多糖［2］是一种非特异性免疫促进剂，其不仅能够提高机体的抗病能力，还有较强的抗癌作用［3］。茯苓有效成分提取工艺，传统方法有水煎、醇提取或乙醚提取等，这些方法效果差，有效成分损失严重，杂质较多，质量不稳定，难以保证药物的疗效。
       
       超临界流体萃取(Supercritical Fluid Extraction,SFE)是一种近年快速发展起来的新型提取分离技术，具有无毒性、选择性强、不易燃、溶剂可循环利用等优点。它特别适合于不稳定天然产物和生理活性物质的分离与精制［4］。为了提高茯苓多糖的质量，我们以茯苓多糖为考察指标，进行用CO2超临界流体萃取茯苓多糖的实验，对茯苓超临界CO2流体萃取工艺进行考察，以确定萃取操作工艺条件，为实现SFE大规模萃取茯苓多糖提供工艺参数。现报道如下。
       1  材料
        茯苓(湖南靖州)，HA121-50-05超临界萃取装置(江苏南通华安超临界萃取有限公司)，二氧化碳，UV2550(日本 岛津)，电子天平，葡萄糖标准品(供含量测定用，批号110833-200503，中国药品生物制品检验所)，苯酚，浓硫酸和铝片等。
       2  方法
       2.1  药材粉碎度的选择　
       超临界萃取中，物料的粒度对提取效率有较大的影响，通常不同质地的物料需选择不同的粒度，才能保证较佳的提取效率。参照文献条件，取不同粒度茯苓药材，在萃取压力25 MPa，萃取温度45℃，解析压力4 MPa等相同条件下萃取2 h，考察粒度对茯苓多糖得率的影响。结果见表1。表1  药材粒度对茯苓多糖得率的影响（略）
        实验结果表明，药材粒度为20～60目时，提取时提取率较好。
       2.2  茯苓提取物中多糖含量的测定方法
       2.2.1  4%苯酚溶液的配制取苯酚100 g，加铝片0.1 g和碳酸氢钠0.05 g，蒸馏并收集182℃馏分，称取4 g，在100 ml容量瓶加水溶解至刻度线，然后放冰箱内冷藏备用(必须在182℃时收集其馏分)。在蒸馏过程中，还要控制好冷凝程度，若冷凝管内的水流量过快，则会很快使得其中的馏分结晶而影响到馏分的正常收集。 
       2.2.2  制备标准曲线精密称取置五氧化二磷减压干燥器中干燥12 h以上的无水葡萄糖标准15 mg，置25 ml容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀置室温下（约240℃）备用（浓度为0.6 mg/ml）。
       
       精密量取对照品溶液0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 ml，分别置于100 ml容量瓶中，并加水至刻度，摇匀。精密量取上述各溶液2 ml，置具塞试管中，分别加入4%的苯酚溶液1 ml，混匀后迅速加入浓硫酸7.0 ml，摇匀，并于45℃水浴中保温30 min后取出，置冰水浴中5 min后取出。然后以第1份为空白对照组，用分光光度法在490 nm的波长处测定其吸收度A，以吸光度A为纵坐标，溶液浓度C为横坐标，进行线性回归。得回归方程：Y=0.011 4+0.018 3X,相关系数r=0.999 5，葡萄糖浓度在0.006～0.03 mg/ml范围内吸光度与浓度呈良好的线性关系。见图1。
       2.2.3  苯酚-硫酸法测茯苓多糖含量将各提取方法所得样品制成1 g/ml的溶液，精密量取2 ml，照标准曲线的制备项下的方法，用紫外分光光度法测定其吸光度，从标准曲线的回归方程中计算出待测溶液浓度，并进一步计算出其多糖含量（以葡萄糖量计）。结果见表3。
       2.3  正交实验设计   
       根据CO2-SFE工艺的影响因素，选取温度、压强、夹带剂用量、萃取时间为考察因素［5，6］，进行L9（34）正交实验，并以茯苓多糖（以葡萄糖计）为评价指标，优选CO2-SFE萃取茯苓多糖最佳工艺。因素水平见表2，结果见表3，方差分析见表4。表2  因素水平设计（略）表3  正交实验结果（略）表4  方差分析（略）
       2.4  结果分析由表3可以知，极差中D项最大，其次为C项，A项最小，即该4个因素对多糖产量的影响程度由大到小为：D>C>B>A。表明在该实验条件下，各因素对茯苓多糖产率影响的主次顺序是：萃取时间>夹带剂(水)用量>萃取压强>萃取温度。由表4可知，因素C、D对多糖产量有显著性影响，其他两个因素没有显著性影响。就多糖产率而言所选适宜的提取工艺为：A1B2C2D3；综合考虑，确定工艺为：A1B3C3D3，即CO2-SFE萃取茯苓多糖的最佳工艺条件为：温度35℃，压强20mPa，夹带剂（水）用量0.4 ml/g，萃取4.0 h。
       
       、2.5  最佳提取工艺验证在上述最佳条件下［温度35℃，压强20mPa，夹带剂（水）用量0.4 ml/g，萃取4.0 h］进行3次重复实验。结果见表5。表5  最佳条件验证实验（略）
        从表5可看出，最佳提取工艺条件具有较好重复性，茯苓多糖得率较高，说明该最佳工艺条件是合理、可靠的。
       3 讨论
        影响超临界CO2萃取的因素有：萃取压力、萃取温度、萃取物颗粒大小、CO2流量、夹带剂等。在本仪器中，CO2流量与萃取压力相关，所以未将其列入考察因素。从实验结果来看，萃取压力水平没有显著性影响，这可能是萃取压力选择过小或萃取压力本身对多糖的萃取没有影响的缘故。至于是哪一原因，将在下一步的实验中继续研究。萃取温度在31.1℃是临界值，高于此温度才是超临界状态， 45℃是超临界萃取常用的较高温度，所以选择35,40,45℃ 3个水平。
       
       在本次CO2超临界流体萃取茯苓多糖的实验过程中采用的是等温变压工艺，即超临界CO2的萃取和分离在同一温度下进行。该工艺由于没有温度的变化，从而操作简单，可实现对高沸点、热敏性、易氧化物质的接近常温的萃取，特别适合于从天然产物中提取有效成分。从实验结果来看，仅因素C、D对萃取茯苓多糖产率的影响具有显著性；茯苓多糖的平均得率为5.276%，超过了文献报道的水提醇沉提取方法所得到的茯苓多糖得率，但是不及用碱液浸提的茯苓多糖的产率［7］，这可能是因为碱液水解了部分没有药理作用的多糖和其他物质的缘故。至于用碱液浸提的茯苓多糖和用二氧化碳超临界流体萃取的茯苓多糖及用水提醇沉方法得到的茯苓多糖的药理作用及相对分子量有什么不同，将在下一步的实验中继续研究。
       
       本研究通过正交实验确定了茯苓多糖最佳萃取条件，并考察了各因素对萃取结果的影响大小，为今后科学地选择超临界CO2萃取多糖条件提供了有益的参考。
       【参考文献】
         　　［1］宋子成.中药风险速查［M］.沈阳:辽宁科学技术出版社,2005：106.
       
       ［2］胡斌,杨益平,叶 阳.茯苓化学成分研究［J］.中草药,2006,37(5):655.
       
       ［3］张璐,刘 强.茯苓多糖制备工艺及药理作用研究进展［J］.中国实验方剂学杂志,2006,12(4):61.
       
       ［4］沈国良.超临界CO2萃取的研究与应用［J］.化工时刊,2001，12:10.
       
       ［5］廖传华,黄振仁.夹带剂对超临界CO2萃取过程的影响［J］.香料香精化妆品,2004，1:34.
       
       ［6］萧效良,甘海涛,戚东林.CO2超临界萃取技术提取中药有效成分［J］.化工进展,2001，5:7.
       
       ［7］周燕霞，唐明林，殷辉安，等. 茯苓中多糖的提取及含量测定［J］.天然产物研究与开发，2003，15（4）：330.