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       【摘要】 
       目的研究大孔树脂吸附法富集一枝蒿总黄酮的工艺条件及参数。 方法以总黄酮为考察指标，用比色法测定含量，考察大孔吸附树脂富集一枝蒿总黄酮的工艺条件。结果一枝蒿提取液（0.04 g生药 /ml ）10 ml上大孔树脂柱（R 15 mm×H 290 mm），吸附30 min后，先用150 ml 蒸馏水洗脱，然后，采用150 ml 70% 乙醇洗脱，洗脱速度为3 ml/min，洗脱剂用量为10倍量树脂，树脂可重复使用3次，采用此条件为最佳工艺。结论HPD-450型大孔树脂在所确定的工艺条件下，可较好地吸附分离一枝蒿总黄酮。其洗脱物中总黄酮含量达3.18% 以上，总黄酮回收率为86.91% 以上。
       【关键词】  一枝蒿；总黄酮；大孔吸附树脂
       Study on the Enrichment Process of Total Flavone from Artemisia rupestris L. with Macroporous Absorption Resin
       RENA·Kasimu, SHENG Ping, YANG Xiaocui
       （Xinjiang Medical University, Urumqi 830054 China ）
       Abstract：ObjectiveTo study the optimal conditions and the technological parameters for enrichment process of total flavone of Artemisia rupestris L. with macroporous absorption resin. MethodsWith the enrichment degree of total flavone of Artemisia rupestris s L..as a marker,  the optimal conditions and technological parameters of the enrichment process were investigated. ResultsThe optimum process was as follows: the concentration of extract of water from the Artemisia rupestris L. was 0.04 g/ ml; eluting velocity, 3 ml/ min; the eluting reagent, 70% ethanol (10 times the volume of the resin); and the HPD-450 resin could be used 3 times repeatedly. ConclusionThe results showed that HPD-450 macroporous resin could well absorb and separate Artemisia rupestris L. total flavone under the set technological conditions, and the content of  total flavone in Artemisia rupestris L. is over 3.18%, with a total flavone recovery rate of over 86.91%.
       Key words：Artemisia rupestris  L.;    Total flavone;    Macroporous absorption resin
       
       新疆一枝蒿Artemisia rupestris L．为菊科Compositae蒿属Artemisia L．苦艾组植物，以全草入药，仅分布在新疆。具有清热解毒、消食健胃、散瘀消肿、抗过敏、解蛇毒、利胆等功能，用于感冒发烧、消化不良、腹胃胀痛、荨麻疹、蛇虫咬伤、肝炎等症［1～6］。其主要成分为黄酮类、倍半萜类、有机酸类化合物［7～8］，其中黄酮类化合物为其主要活性成分。本文采用大孔树脂吸附技术，以一枝蒿主要活性成分总黄酮为评价指标，对9种树脂进行了筛选并着重考察了HPD-450型大孔吸附树脂富集一枝蒿总黄酮的工艺条件与参数。现报道如下。
       1  材料与仪器
       1.1 药材及试剂
       芦丁对照品(中国药品生物制品检定所，批号100080-200306)，新疆一枝蒿Artemisia rupestris L．实验药材由新疆维吾尔自治区人民医院药剂科提供并给予品种确认；AB-8型大孔吸附树脂(天津市光复精细化工研究所)，HPD-100，HPD-300，HPD-400，HPD-450，HPD-500树脂（河北沧州宝恩化工有限公司），HP-20树脂、HP2MGL树脂、SP-825树脂（日本三菱公司）。所用试剂均为分析纯。
       1.2 仪器
       Spectrumlab 54 紫外分光光度计(上海市棱光有限公司)；  KQ-400DB型数控超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司)； 电子天平(Sartorius 德国产)；  DZF-6021型真空干燥箱(上海精密实验设备有限公司)；  DRT-SX型恒温电热套（郑州长城科工贸有限公司）；RE-52旋转式蒸发器(上海安亭电子仪器厂)。
       2  方法与结果
       2.1 一枝蒿总黄酮的含量测定
       2.1.1  比色原理和最大吸收波长的选择一枝蒿中含有多种黄酮类化合物，其黄酮母核所含的游离羟基，在适当的介质条件下能与金属铝离子形成络合物而显色。显色后对照品和供试品溶液有相似的吸收光谱，见图1。
        由图1可知，二者在498 nm处均有最大吸收，故测定波长选择498 nm。
       2.1.2 对照品溶液的制备
       精密称取在120 ℃减压干燥至恒重的芦丁对照品10 mg，置50 ml容量瓶中，加甲醇少许，置水浴上微热使溶解，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，即得，备用。
        精密量取芦丁对照品溶液0，1，2，3，4，5，6 ml，分别置25 ml容量瓶中，各加水至6 ml，加5% 亚硝酸钠溶液1 ml使混匀，放置6 min，加10% 硝酸铝溶液1 ml，混匀，放置6 min，加氢氧化钠溶液10 ml，再加水至刻度，混匀，放置15 min，照分光光度法在498 nm波长处测定吸光度，以吸光度（A）为纵坐标，质量浓度（C）为横坐标绘制标准曲线，标准曲线方程为A = 11.019 C + 0.0017，r = 0.9998。
       2.1.3 供试品溶液制备和总黄酮含量测定
       一枝蒿药材20 g，加14倍量蒸馏水回流提取3次，30 min/次，过滤，合并滤液，浓缩，定容至500 ml（0.04 g生药 / ml）作为样品液。从中吸取0.8 ml照标准曲线项下方法“加水至6 ml”依法测定吸光度，测得一枝蒿总黄酮含量为3.74% ， RSD=1.25% (n=5)。
       2.2  树脂的筛选
       2.2.1  大孔吸附树脂的预处理以乙醇湿法装柱,用95% 乙醇在柱上流动清洗，不时检出流出液至乙醇液与水混合(1∶5)不成白色混浊为止，然后以大量蒸馏水洗去乙醇至无醇味。
       2.2.2  树脂的筛选精密吸取5 ml一枝蒿样品液分别通过9种不同型号的已预处理好的树脂柱，静置30 min，依次用蒸馏水、70% 乙醇洗脱，收集70% 乙醇洗脱液，蒸干，用蒸馏水定容于10 ml容量瓶中，从中精密吸取2.5 ml，照标准曲线项下方法“加水至6 ml”依法测定吸光度，测定一枝蒿总黄酮含量，并计算总黄酮回收率，结果见表1。表1  不同型号树脂对总黄酮含量的影响（略）
        由表1可见，在筛选的9种树脂中，用HPD-450树脂纯化分离一枝蒿总黄酮，总黄酮量和总黄酮回收率均最高，故确定HPD-450树脂为分离纯化一枝蒿总黄酮的最佳树脂。
       2.3 考察HPD-450树脂富集一枝蒿总黄酮的工艺参数
       2.3.1 洗脱剂的考察精密吸取5 ml一枝蒿样品液分别通过4根HPD-450树脂柱，4根树脂柱分别用水洗脱至洗脱液近无色，再分别用30% ，50% ，70% ，90% 乙醇洗脱，分别回收洗脱液，蒸干， 用蒸馏水定容于10 ml容量瓶中，从中精密吸取2.5 ml，照标准曲线项下方法“加水至6 ml”依法测定吸光度，测定一枝蒿总黄酮含量，计算总黄酮回收率。结果见表2。表2 不同浓度洗脱剂对一枝蒿总黄酮的影响（略）
        表2结果显示，70% 乙醇洗脱液中总黄酮含量和回收率均最高，故确定70% 乙醇液为最佳洗脱剂。
       2.3.2 最佳上柱量的考察分别吸取一枝蒿样品液4，5，10，15 ml上柱且静置30 min，依次用蒸馏水150 ml，70% 乙醇150 ml洗脱，测定总黄酮含量，计算总黄酮回收率。结果见表3。表3  不同上柱量对一枝蒿总黄酮的影响（略）
       由表3可见，上柱量为10 ml时，洗脱液的总黄酮含量及总黄酮回收率均最高，说明10 ml上柱量是HPD-450的饱和上柱量。故选择10 ml为最佳上柱量。
       2.3.3 洗脱速度的考察分别吸取一枝蒿样品液10 ml上4根树脂柱，以蒸馏水和70% 乙醇洗脱，分别以1，2，3，4 ml / min的速度洗脱，测定其总黄酮含量，并计算总黄酮回收率。结果见表4。表4  不同洗脱流速对一枝蒿总黄酮含量影响的考察结果（略）
        由表4可见，洗脱流速为3 ml/ min时，总黄酮含量与回收率均最大，故确定最佳洗脱流速为3 ml/min 。
       2.3.4 最佳吸附时间的考察分别吸取10 ml样品液4份，通过4根树脂柱，分别静置5，15，30，60 min，依次用蒸馏水，70% 乙醇洗脱，收集洗脱液，测定总黄酮含量，计算总黄酮回收率。结果见表5。表5 不同吸附时间对一枝蒿总黄酮的影响（略）
        由表5可见，吸附时间为30 min时总黄酮含量与其回收率均最高。故确定最佳吸附时间为30 min。
       2.3.5 洗脱曲线的考察按上述确定的吸附洗脱条件，吸取10 ml一枝蒿样品液进行过柱，分段收集洗脱液，每个树脂体积（湿体积）收集1份，共收集15份，分别测定吸光度，并计算总黄酮含量。结果见表6。表6  不同流份中总黄酮含量的比较（略）
        由表6可知，第11份洗脱液中总黄酮含量已经很少，可认为树脂柱上吸附的总黄酮已经洗脱完全，故确定洗脱剂用量为10倍量树脂体积。
       2.3.6 树脂重复使用次数考察按上述确定的吸附洗脱条件，取一枝蒿样品液进行过柱，在同一根树脂柱上重复操作7次，分别计算7次的总黄酮含量与其回收率。结果见表7。表7  树脂重复过柱对总黄酮含量的影响（略）
        由表7可知，树脂重复使用3次后，一枝蒿总黄酮含量及回收率均已明显下降，需要再生才可继续使用，故确定树脂可重复使用3次。
       3  讨论
        用大孔树脂吸附，70% 乙醇洗脱一枝蒿总黄酮，并采取比色法测定总黄酮含量。实验结果证明HPD-450型大孔吸附树脂对一枝蒿总黄酮有良好的分离富集性能。其最佳工艺条件为：一枝蒿提取液上样浓度为0.04 g生药/ ml，上样量为10 ml，洗脱溶剂为70% 乙醇，洗脱剂用量为10倍量树脂体积，吸附时间为30 min，洗脱速度为3 ml/ min，树脂可重复使用3次。在此条件下，洗脱物中一枝蒿总黄酮含量达3.18% 以上，总黄酮回收率达86.91% 以上。
       
       样品经过大孔吸附树脂吸附，70%乙醇洗脱后，对洗脱液蒸干后的溶解性能进行了考察。结果表明，蒸馏水对本样品的总黄酮有更好的溶解性，故在所有条件的考察中，洗脱液蒸干后均用蒸馏水做溶解定容试剂。
       
       大孔吸附树脂是一种人工合成的多聚物吸附剂，其吸附能力是由树脂孔径、比表面积、表面电性或形成氢键等因素共同决定的。这些因素又成为大孔树脂吸附能力大小的影响因素。尽管大孔吸附树脂自身也存在一些问题，如：溶剂和致孔剂残留、吸附效果易受流速和上样浓度等的影响等,但大孔吸附树脂比其他天然吸附剂具有不可代替的优点：其不但孔径大小、比表面积、极性等可以任意选择；而且具有吸附快、解析率高、吸附容量大、树脂再生简单等诸多优势，使其在中药及其制剂的研究中应用越来越多，应用前景广阔。
       【参考文献】
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