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       【摘要】 
       目的优化植物超氧化物歧化酶（SOD）的制备工艺。方法用热变性沉淀、等电点沉淀，45%，90%硫酸铵分级沉淀、DEAE-纤维素离子交换层析，冷冻浓缩干燥等方法，从黄瓜中制备SOD，并用聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。用考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量，用NBT光还原法测定SOD活性。结果SOD酶比活为89.2381 U·mg-1，回收率为18.41%，提纯倍数为11.02倍。结论该工艺简便高效地从植物中提纯超氧化物歧化酶，可用于生产实际。
       【关键词】  超氧化物歧化酶； 制备工艺； SOD酶活力
       Study on an Extraction Technology of Superoxide Dismutase from Plants
       JIANG Hongxia，JI Benhua，ZHU Suqin
       (1.College of Life Sciences, Nantong University, Nantong 226007，China；2.Midu Middle School,Suzhou 215006，China;  3. Institute of Bioengineering, Nantong University, Nantong 226007，China)
       Abstract：ObjectiveTo optimize the extraction technology of superoxide dismutase from plants. MethodsWe extracted SOD from the cucumber by heat treatment , isoelectric fraction, ammonium sulfate fractionation and ion exchange chromatography, Coomassie brilliant blue G-250 was adopted to determine the content of the protein and NBT-reduction was used to measure the SOD activity. Meanwhile, the purified substance was identified as SOD by the polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) and SOD activity staining. ResultsSOD had a specific activity of 89.2381 U·mg-1. The yield rate was 18.41%, and the multiplication was as 11.02 times. ConclusionThe technology is an extraction technology of superoxide dismutase form plants simply and efficiently and it will be a good reference for the production.
       Key words：Superoxide dismutase(SOD)；  Extraction technology；  Activity of SOD
       
       超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)，作为一种专一清除生物体内超氧阴离子自由基(O2-·)的酶，催化超氧阴离子自由基发生歧化反应，减少超氧阴离子自由基对生物体的毒害。目前，人们已从动物、植物和微生物体内分离得到，并且通过多种方法应用到实际中［1］，如应用到医药方面、食品、农业、化妆品及人和动植物许多疾病的监测方面等。
       
       植物超氧化物歧化酶的制备工艺，其主要目的是纯化植物中的SOD，最大限度地清除杂蛋白，因此，常用的方法主要有热变性法、等电点沉淀法、盐析法、有机溶剂沉淀法、超滤法、层析法等［2］。而本文主要探究超氧化物歧化酶的制备工艺，比较几种常用工艺，热变性法和等电点沉淀法简单，不需加其他试剂，但不能大幅度提高SOD的比活；盐析法有利于保持蛋白质的生理活性，但分辨率低［3］；离子交换层析主要用于高纯度的SOD精品的制备，处理量小。本研究将几种简单工艺相结合，扬长避短，找出一套既简便又能有效提高SOD纯化倍数的方法。
       1  材料与方法
       1.1 材料与试剂
       黄瓜；氯化硝基四氮唑蓝(NBT)、甲硫氨酸、二乙基氨基乙基纤维素(DEAE)、四甲基乙二胺(TEMED)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、丙烯酰胺(国药集团化学试剂有限公司)、甲叉双丙烯酰胺(中国医药集团上海化学试剂公司)等化学试剂均为分析纯；标准蛋白采用上海生物化学试剂公司产的牛血清白蛋白；考马斯亮蓝G-250(上海化学试剂分装厂)。
       1.2 仪器
       722光栅分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)；DYY-Ⅲ2稳压稳流电泳仪(北京市六一仪器厂)；电热恒温水浴锅 JK-S26型(上海华联医疗器械有限公司)；高速冷冻离心机D-37520(Osterode Kendro Laboratory Products)；LGJ-10冷冻干燥机(军事医学科学院实验仪器厂研制，北京松源滑行科技发展有限公司制造) ；HD-3紫外检测仪(上海沪西分析仪器厂)；DHL-A电脑恒流泵(上海沪西分析仪器厂)；DBS-100电脑全自动部分收集器(上海沪西分析仪器厂)。
       1.3 方法
       将黄瓜用清水洗净，称取100 g，以1.5∶1 比例［3］加入pH7.8，0.05 mol/L的磷酸盐缓冲液150 ml，先加75 ml磷酸盐缓冲液和少许石英砂，用高速组织捣碎机充分搅碎，在12 000 r/min，4℃离心40 min，使悬浮物完全沉淀，取沉淀再加入75 ml磷酸盐缓冲液，冰浴充分研磨，并12 000 r/min，4℃下离心40 min，弃去沉淀，合并两次上清液，制得粗酶液。将粗酶液静置于55℃恒温水浴锅中25 min，进行热变性，使杂蛋白变性沉淀下来，再在4℃下12 000 r/min离心20 min，弃去沉淀，保留上清液。用0.1 mol/L盐酸调节上清液，使其pH达到5.0，在4℃下12 000 r/min离心20 min，收集上清液。在上清液中加入固体硫酸铵粉末，使溶液达到45%的饱和度后，用玻璃棒搅拌30 min，然后冷藏静置2h，再在4℃，12 000 r/min离心40 min，去除沉淀，取上清液；再加入固体硫酸铵粉末到90%饱和度，搅拌30 min，冷藏过夜，再在4℃，12 000 r/min离心60 min，取沉淀，溶解于pH7.8，0.05 mol/L的磷酸盐缓冲液中，4℃透析过夜，待上柱。
       
       预先处理DEAE-纤维素，装柱，将待上柱的酶液加入层析柱中，用pH7.8，0.05 mol/L的磷酸盐缓冲液进行洗脱，洗脱速度控制在3 ml/min，以每管3 ml收集洗脱物，收集70管，将收集SOD活性峰的部分合并，测定蛋白峰处各管的酶活力(U)及蛋白质含量(mg)。将收集的酶液，4℃透析，再置于－70℃冰箱中，冷冻过夜，用冷冻干燥机将酶液制成干粉，即为成品。
       1.4  SOD的鉴定本实验采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)及SOD酶活性染色来鉴定纯化物确为SOD［4］。
       1.5  超氧化物歧化酶(SOD)活力测定用NBT光还原法来测定超氧化物歧化酶的活性，根据光照时体系中产生氧自由基使NBT还原成蓝色甲簪(在560 nm处有一吸收峰)，而超氧化物歧化酶作为氧自由基的清除剂可抑制此反应。酶活性单位采用抑制NBT光还原50%为一个酶活性单位表示［5］。
       1.6  蛋白质含量测定以考马斯亮蓝G250在595 nm波长下制作标准曲线，再进行样品液中蛋白质含量测定，根据所测定的A595值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，重复3次取平均值，通过计算求出样品中蛋白质含量(mg)。
       2 结果
       2.1  沉淀法分离SOD本实验通过热变性沉淀法、等电点沉淀法从黄瓜中分离SOD，在此过程中，热变性温度、pH的选择均对分离提取SOD存在影响。
       2.1.1  热变性温度对提取SOD的影响SOD是一种热稳定性很好的酶。当温度低于80℃时，短时间的热处理，酶活力不会有明显的变化，而一般杂蛋白却在高于55℃时就易变性沉淀。因此选择不同温度及时间对粗酶液进行热击。酶活性结果见表1。表1  热变性温度和时间对SOD活性(U)的影响（略）
        表1结果表明，在55℃下热击25 min时，酶活性最大，因此确定选择在此温度、时间进行处理；则SOD粗酶液在热击前后结果见表2。表2 热变性前后处理结果比较（略）
        从表2可发现，热变性前后，总蛋白含量从23.362 4 mg下降到13.9373 mg，而SOD酶活却没有明显变化，说明粗提液中部分杂蛋白被除去，而单用此方法提纯SOD，其纯化倍数为1.48倍。
       2.1.2  不同pH对分离SOD的影响在pH值1.0～7.0范围内，调节SOD粗酶液的pH值，研究不同pH对SOD分离的影响。结果如图1。
        从图1可知，用等电点沉淀法处理粗酶液，在pH=5.0时，总蛋白含量最低为8.69 mg，SOD总活力最高为115.42 U，比活为13.2819 U·mg-1，纯化倍数为1.64倍；pH大于5.0后，总蛋白含量逐渐恢复，说明大部分蛋白在pH为5.0时被去除，此时纯化效果最佳。
       2.2  硫酸铵分级沉淀法浓缩SOD对SOD粗酶液进行硫酸铵分级沉淀，首先选择最佳的硫酸铵饱和度(30%～55%)清除杂蛋白，12 000 r/min离心40 min，弃去沉淀，测出上清液中总蛋白质含量及总SOD酶活性(见表3)，再选择一定浓度的硫酸铵饱和溶液(60%～90%)，使SOD呈盐析状态，沉淀出来，测定其总蛋白质含量及总酶活。结果见表4。表3  第1步硫酸铵沉淀结果（略）
        表3～4结果表明，用硫酸铵分级沉淀法处理粗酶液，在饱和度为45%和饱和度90%时，SOD比活最高，分别为17.026 6 U·mg-1和20.6514 U·mg-1，说明分离效果最明显，因此若用此方法提纯，其纯化倍数分别为2.10和2.55。
       2.3  综合法提纯SOD按本实验的方法，将热变性法、等电点沉淀法、硫酸铵分级沉淀法相结合处理，再经DEAE-纤维素离子交换柱(1.5 cm×25 cm)层析纯化，用pH7.8，0.05mol/L的磷酸缓冲液洗脱，流速在3 ml/min，每管收集3ml洗脱液，洗脱曲线和酶活测定结果如图2。洗脱曲线上出现2个蛋白峰：Ⅰ，Ⅱ，经活力测定后发现酶活性峰与峰Ⅱ基本重合，所以峰Ⅰ为杂蛋白，合并SOD活性部分，4℃透析，再置于－70℃冰箱中，冷冻过夜，冷冻干燥浓缩后，用于电泳鉴定。表4  第2步硫酸铵沉淀结果（略）
        此综合法的提纯效果与单一方法提纯相比，SOD酶比活力明显有大幅度的提高。结果见表5。 表5  综合法分离提纯黄瓜超氧化物歧化酶的结果（略）
        从表5中可以看出，黄瓜SOD分离纯化前的比活为8.0959 U·mg-1，经最终纯化后的比活为89.2381 U·mg-1，纯化倍数为11.02，回收率为18.41%。
       2.4  电泳鉴定SOD将浓缩干燥后的成品，溶解于pH7.8，0.05 mol/L的磷酸缓冲液中，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳6 h，用SOD活性染色见图3。
       
       由图3可见，提纯后的物质经电泳处理，再进行SOD活性染色后，出现一条透明条带。因此，可以确定，该提纯物质确为超氧化物歧化酶。
       3  讨论
       3.1  实验误差实验过程中，对SOD各步的酶活力和总蛋白含量进行计算，其比活和纯化倍数较低，可能与操作过程中样品放置时间的长短和试材的质量有关；另外，在运用聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定SOD时，发现最终的电泳条带只有一条，可能是由于提纯物中还存在一定量的杂蛋白；也可能与点样中SOD含量有关，据有关文献显示，通过离子交换后，总蛋白含量一般在4～10 mg［6，7］,而本实验只是从100 g黄瓜中提取，其最终总蛋白含量为0.390 2 mg，因此其余两条带不能清晰显现。
       3.2  单一方法与综合法的比较从结果分析可知，若用热变性法处理粗酶液，在55℃下热击25 min，部分杂蛋白被去除，比活从8.095 9 U·mg-1上升至12.005 0 U·mg-1，此工艺的纯化倍数为1.48，回收率为88.47%；若用等电点沉淀法，选择pH=5.0时处理粗酶液，则提纯后总蛋白含量为8.69 mg，酶总活力为115.42 U，比活为13.281 9 U·mg-1，纯化倍数为1.64，回收率为61.03%；若只采用45%和90%的饱和硫酸铵处理粗酶液时，酶的比活则分别为17.026 6 U·mg-1和20.651 4 U·mg-1，纯化倍数分别为2.10和2.55，回收率分别为98.04%和92.71%。而用综合法提纯SOD，提纯后总蛋白含量为0.390 2 mg，酶总活力为34.820 7 U，比活为89.238 1 U·mg-1，纯化倍数为11.02，回收率为18.41%。因此可以看出，用单一方法提纯粗酶液，其比活和纯化倍数均不是很高，说明单一方法分离提纯SOD，不能有效提高其纯度。
       3.3  在实际中的应用从整个制备工艺提纯后的回收率中，我们发现提纯步骤越多，最终获得的蛋白含量越少，也就是说，在每步提纯之后，杂蛋白被逐渐去除了，达到了预期的目的。但从另一方面看，若将此方法用于工业化生产，虽说最终SOD酶比活力能达到89.238 1 U·mg-1，可回收率却只有18.41%，那么在投放市场后，企业的投入与产出就不能有效地达到平衡。所以，若作为企业生产，则最好是酶的比活要高，且回收率也要高，要在两者之间寻找一个平衡点。（见图4）。由图4可知，在第4、第5步时，即在硫酸铵分级沉淀后，比活与回收率乘积最高，此时比活约为45.005 6 U·mg-1，回收率约为58.57%，最适宜企业生产，最可能得到可观收益。
       
       综合考虑，若要获取高比活的精制品，则本实验工艺可以满足需求；若要符合实际生产投放市场，则可适当减少提出步骤，提纯工艺只到硫酸铵分级沉淀为止。
                     
        通过将黄瓜粗酶液经热变性沉淀、等电点沉淀处理后，再经45%，90%硫酸铵分级沉淀和DEAE-纤维素离子交换层析，四步纯化后，用聚丙烯酰胺凝胶电泳及SOD活性染色进行鉴定，确定提取得到的为黄瓜SOD酶。实验结果表明，黄瓜SOD酶的比活为89.238 1 U·mg-1，回收率为18.41%，提纯倍数为11.02倍，工艺所用时间约为48 h；很明显，提纯效果比单一使用某一方法要好。因此若要获取高比活的精制品，则本工艺可以满足需求；若要符合实际生产投放市场，则可适当减少提纯步骤，提纯工艺只到硫酸铵分级沉淀为止。
       【参考文献】
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