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       【摘要】 
       目的初步筛选补骨脂平喘有效部位。方法建立大鼠哮喘模型，采用ELISA法检测补骨脂不同溶剂提取物对血清IFNγ/IL-4/IL25含量的影响，筛选补骨脂平喘有效部位。结果①对IL5含量的影响：醇提浸膏、醇提水萃取物、水提取物和醇提甲醇洗脱物对血清IL-5含量抑制明显，而醇提石油醚萃取物、醇提醋酸乙酯萃取物抑制作用不明显。②对IL-4含量的影响：醇提浸膏、醇提石油醚萃取物和水提物对血清IL-4含量有较强的升高作用，而醇提醋酸乙酯萃取物、醇提水萃取物和醇提甲醇洗脱物作用不明显。③对IIFNγ含量的影响：醇提浸膏和醇提石油醚萃取物明显提高IFNγ含量，而醇提醋酸乙酯萃取物、醇提水萃取物和醇提甲醇洗脱物却降低大鼠体内血清IIFNγ含量，水提取物对IIFNγ含量影响不明显。结论补骨脂乙醇提取物浸膏、石油醚萃取物和甲醇洗脱物是补骨脂平喘主要有效部位。
       【关键词】  补骨脂 哮喘 有效部位筛选
       Screening of Antiasthmatic Active Constituents of Psoralea Fruits
       HU Xuejun，  DENG Shigui*，HAN Ling， LI Weiying,WU Zhifeng
       2nd Clinical Medical School of Guangzhou University of TCM，Guangzhou 510120，China
       Abstract：ObjectiveTo screen the antiasthmatic active constituents of Psoralea Fruits.    MethodsAfter animal model in rats was established, the concentration of IFNγ,IL4,IL5 in serum were detected by ELISA after each solvent extraction being administered to rats． Then the antiasthmatic active constituents of psoralea fruits was screened according to the effect.   Results①About IL-5:compared with the normal group，the contents of IL-5 in serum were significantly restrained in the following groups including the ethanol-extracted extractum group, ethanol-extracted H2Oabstraction group, H2Oextracted extractum group, and ethanol-extracted methanol- eluate group, respectively; while not significantly in ethanol-extracted ligarine-abstraction group and ethanol-extracted acetoacetate- abstraction group, respectively.  ②About IL4: compared with the normal group，the contents of IL4 in serum were significantly increased in ethanol-extracted extractum group, ethanol-extracted ligarine-abstraction group and H2Oextracted extractum group, respectively; while not significantly in ethanolextracted acetoacetate- abstraction group, ethanol-extracted H2Oabstraction group and  ethanol-extracted methanol- eluate group, respectively.   ③About IFN-γ, compared with the normal group，the contents of IFN-γ in serum were significantly increased in following groups including ethanol-extracted extractum group, ethanol-extracted ligarine-abstraction group, respectively; while were decreased in ethanol-extracted acetoacetate- abstraction group, ethanol-extracted H2O-abstraction group, ethanol-extracted methanol- eluate group, and no significant change in H2O-extracted extractum group.    ConclusionEthanol-extractum, ligarine-abstraction and methanol-eluate are mainly antiasthmatic active constituents of psoralea fruits.
       Key words：Psoralea Fruits；  Asthma；  Screening of Active
       补骨脂是临床上常用的补肾助阳中药，具平喘之功，临床上常用于虚寒喘嗽。化学成分主要含黄酮类和香豆素类［1］。呼吸科专家、中国工程院院士钟南山教授指出补骨脂是今后应加强研究和开发的抗气道炎症中药之一［2］。广东省中医医院从20世纪80年代初始用补骨脂注射液治疗支气管哮喘取得了理想的疗效，但其作用的物质基础并不清楚［3］。我们初步研究发现，补骨脂醇提部分黑色粘稠层对组胺哮喘潜伏期有显著的延长作用［4，5］。说明补骨脂确有平喘作用，且其有效成分可能主要在非水溶性部分。而目前已开发的补骨脂剂型，工艺多取水溶性部位。因此，本实验以平喘作用密切相关指标为指标，比较不同溶剂提取的补骨脂成分对卵蛋白哮喘大鼠血清IFN-γ/IL-4/IL-5含量的影响［6］，初步筛选补骨脂平喘作用的有效部位，为进一步将补骨脂开发为疗效确切、质量可控的平喘药打下基础，实验研究结果如下。
       1  材料与仪器
       1.1  动物
       SD大鼠，70只，SPF级，雌雄各半，180 g左右，合格证号：0012625，由广州中医药大学实验动物中心提供。
       1.2  试剂
       卵白蛋白 批号：970612上海化学试剂公司；氢氧化铝干粉 批号：20020301-2 广州化学试剂厂；灭活百日咳杆菌（100亿个/ml） 广东省中医院提供；大鼠IL-4（批号20060620）、IFN-γ（批号20060620）ELISA试剂盒由晶美生物工程有限公司提供；IL-5（批号20983008）ELISA试剂盒由Bander Medsystems提供。
       1.3  补骨脂不同溶剂提取物补骨脂95%乙醇提取物浸膏，浓度：3.45 g药材/ml（简称浸膏）；补骨脂95%乙醇提取石油醚萃取物，浓度：10.0 g药材/ml（简称石油醚萃取物）；补骨脂95%乙醇提取醋酸乙酯萃取物，浓度：6.67 g药材/ml（简称醋酸乙酯萃取物）；补骨脂95%乙醇提取水萃取物，浓度：10.0 g药材/ml（水萃取物）；补骨脂水提取物，浓度：10.0 g药材/ml（简称水提取物）；补骨脂95%乙醇提甲醇洗脱物，浓度：2 g药材/ml（简称甲醇洗脱物），以上试剂均由广州中医药大学中药学院提供。
       1.4  仪器酶标仪BIO-RADS Model 550，日本；CSW-Ⅰ型超声雾化器  汕头光电研究所；10L玻璃干燥器。
       2  方法
       2.1  分组
       将动物随机分成7组，10只/组：哮喘模型组（给水，1.0 ml/100 g）、浸膏组（药材0.9 g/100 g）、石油醚萃取物组（药材2.5 g/100 g）、醋酸乙酯萃取物组（药材1.7 g/100 g）、水萃取物组（药材2.5 g/100 g）、水提取物组（药材10.0 g/100 g）、甲醇洗脱物组（药材2.5 g/100 g）。以上各组动物连续灌胃给药治疗10次，1次/d。末次治疗后2 h，各组动物心脏采血5 ml，1 000 r/min离心15 min，血清分装（1 ml/管）保存于－70℃低温冰箱内待测：IL-4，IFN-γ，IL-5（严格按照ELISA试剂盒说明书分别检测）。
       2.2  卵蛋白哮喘大鼠模型的建立
       2.2.1  大鼠致敏
       上述分组中每只动物腹腔注射抗原液0.5 ml/100 g (含卵蛋白100 mg、氢氧化铝干粉100 mg和2.5×109个百日咳杆菌/ml,制成悬浊液)［7］致敏第1次,次日每只大鼠再次腹腔注射0.5 ml/只致敏液加强。
       2.2.2  激发和治疗
       首次致敏后第15天，于每天上午8～9时大鼠置于10 L玻璃干燥器内超声雾化吸入2%卵蛋白20 min激发哮喘,连续14 d。激发后第4天起，于每天激发后大鼠口服给相应试剂治疗（见“2.1 实验分组”）。正常组以生理盐水取代抗原液按0.5 ml/100 g腹腔注射致敏大鼠，第2天以0.5 ml/只腹腔注射生理盐水加强；首次致敏后第15天，每天上午8～9时该组大鼠超声雾化吸入生理盐水20 min激发哮喘,连续14 d。激发后第4天起，于每天激发后大鼠口服给蒸馏水治疗。
       2.3   统计分析结果
       采用四川大学黄志勇主编的（PEMS 3.0）《中国医学百科全书·医学统计学》统计软件包进行统计：两组均数比较t检验（方差齐）或t′（方差不齐）。
       3  结果
       3.1  补骨脂不同溶剂提取物对哮喘大鼠IL-5含量的影响结果见表1。由表1可见，大鼠服用补骨脂不同溶剂提取物后，血清IL-5含量呈下降趋势，其中补骨脂浸膏、水萃取物、水提取和甲醇洗脱物各成分组大鼠血清IL-5含量降低明显，与哮喘模型组比较P<0.05或P<0.01，差异有显著意义。而石油醚和醋酸乙酯萃取物两成分组大鼠血清IL-5含量降低不明显，与哮喘模型组比较P>0.05，无显著性差异。
       3.2  补骨脂不同溶剂提取物对哮喘大鼠IL-4含量的影响结果见表1。由表1可见，大鼠服用补骨脂不同溶剂提取物后，血清IL-4含量呈升高趋势，其中补骨脂浸膏、石油醚萃取物和水提取物各成分组大鼠血清IL-4含量升高明显，与哮喘模型组比较P<0.05或P<0.01，差异有显著意义。而醋酸乙酯萃取物、水萃取物和甲醇洗脱物三成分组大鼠血清IL-4含量升高不明显，与哮喘模型组比较P>0.05，无显著性差异。
       3.3  补骨脂不同溶剂提取物对哮喘大鼠IFN-γ含量的影响结果见表1。由表1可见，大鼠服用补骨脂不同溶剂提取物后，不同溶剂成分大鼠血清IFN-γ含量升降不一致，其中补骨脂浸膏和石油醚萃取物两成分组大鼠血清IFN-γ含量升高明显，与哮喘模型组比较P<0.05，差异有显著意义。醋酸乙酯萃取物、水萃取物和甲醇洗脱物三成分组大鼠血清IFN-γ含量减低显著，与哮喘模型组比较P<0.05或P<0.01，有显著性差异，而补骨脂水提对IFN-γ含量未见明显影响，与哮喘模型组比较P>0.05，无显著性差异。表1  不同提取物对哮喘大鼠IL-5，IL-4，IFN-γ含量的影响(略)
       3.4  补骨脂不同溶剂提取物对哮喘大鼠 Th1/Th2（IFN-γ/IL-5）的影响哮喘模型组、醇提浸膏组、石油醚萃取组、甲醇洗脱物组和水提取物组的Th1/Th2比值依次为（n=10)：0.5±0.2，1.1±0.5，0.9±0.5，0.8±0.4和1.2±0.5。提示，大鼠服用补骨脂醇提上述4种溶剂萃取物后，血清Th1/Th2比值呈增加明显，与哮喘模型组比较P<0.05，差异有显著意义。而醋酸乙酯萃取物（0.4±0.2，n=10）和水萃取物（0.6±0.2，n=10）两成分组大鼠血清Th1/Th2降低或增加不明显，与哮喘模型组比较P＞0.05，无显著性差异。
       4  讨论
       哮喘与Th1细胞分泌的IFN-γ等细胞因子及Th2细胞产生的IL-4，IL-5等细胞因子含量和Th1/Th2比值密切相关。Th2的主要代表产物IL-4，能促进B细胞产生IgE，引发炎症介质释放的链式反应，促进炎症细胞的趋化聚集，引起呼吸道血管通透性增加和粘膜水肿，平滑肌痉挛及粘液分泌亢进，是引起哮喘的重要因素。Th1的主要代表产物是IFN-γ，能抑制IL-4，IL-5等细胞因子的产生，进而抑制IgE的产生和Eos活性，抑制IAR和LAR，是哮喘免疫调节中的一个重要的抑制因子，许多细胞因子通过它发挥生物效应［8］。因此，采用IFN-γ，IL-5，IL-4作为哮喘敏感指标进行药物筛选具有合理性。补骨脂是临床上常用的补肾助阳中药，具平喘之功，临床上常用于虚寒喘咳［9］。补骨脂是今后应加强研究和开发的抗气道抗炎症中药之一［2］。我院从20世纪80年代初使用补骨脂注射液治疗支气管哮喘取得了理想的疗效，但其作用的物质基础并不清楚。因此，我们在前期研究的基础上［2，3］，采用卵蛋白哮喘大鼠为模型，以体内血清IFN-γ/IL-4/IL-5含量变化为指标，初步筛选补骨脂平喘作用的有效部位。
       从IFN-γ含量变化来看，补骨脂95%乙醇提取物浸膏和补骨脂95%乙醇提取石油醚萃取物作用明显，可能是补骨脂平喘的主要成分，但从抑制IL-5和IL-4含量分析，补骨脂95%乙醇提取水萃取物和补骨脂95%乙醇提甲醇洗脱物对Th2细胞产生的IL-4，IL-5细胞因子有较强的抑制作用，其他成分却升高或对IL-5 ，IL-4没有显著影响，而补骨脂水提取物对IFN-γ含量提高作用不明显。另外，补骨脂95%醇提水萃取物显著降低IL-5和IFN-γ含量，同时在给药的过程中我们发现水萃取物的毒性明显强于其他成分，这与其肾毒性是否相关值得关注。根据以上分析，我们初步推测补骨脂平喘有效部位应该主要是醇提成分：补骨脂95%乙醇提取物浸膏，补骨脂95%乙醇提取石油醚萃取物和甲醇洗脱物。
       从哮喘中考察Th1/Th2的比值变化更具有意义［10］，因此我们以IFN-γ/IL-5为例，分析Th1/Th2的变化，探讨补骨脂3个醇提成分（浸膏、石油醚萃取物和甲醇洗脱物）哪个为平喘的最佳有效部位。哮喘模型组、醇提浸膏组、石油醚萃取物组和甲醇洗脱物组的Th1/Th2依次为（n=10）：0.5±0.2，1.1±0.5，0.9±0.5和0.8±0.4，与哮喘组比较三者的P<0.05，差异有显著意义，但醇提浸膏的比值更大。因此结合前面的分析，我们认为三者的平喘作用大小依次为：补骨脂95%乙醇提取物浸膏>补骨脂95%乙醇提甲醇洗脱物=补骨脂95%乙醇提取石油醚萃取物。
       【参考文献】
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