文章标题 全文   多个检索词，请用空格间隔。

       【摘要】 
       目的建立适于柴胡ISSR分析的PCR反应体系；筛选适宜引物，并确定最佳退火温度。方法CTAB法提取叶片DNA，通过单因子实验分别找出合适的ISSR-PCR反应条件，利用梯度PCR确定引物最佳退火温度。结果适于柴胡ISSR分析的PCR反应体系为25 μl总体积中含有1× Taq 酶缓冲液，2.0 mmol/L MgCl2，各0.15 mmol/L的dNTPs，0.3 μmol/L引物，1.5 U Taq酶(上海生工)，20 ng 模板DNA，2%去离子甲酰胺。在100条引物中筛选出30条扩增条带清晰且条带数目较多的引物，最佳退火温度为49.9～63.6℃（因引物不同而异）。结论建立了柴胡ISSR-PCR反应体系，筛选出30条引物并确定了最佳退火温度，为应用ISSR技术鉴定柴胡种质资源、分子标记辅助选择育种及其遗传多样性研究奠定了基础。
       【关键词】  柴胡 基因组DNA提取 ISSR PCR
       Establishment and Optimization of ISSR-PCR Reaction System for Bupleurum chinense DC.
       SUI Chun,  WEI Jianhe, CHEN Shilin,YANG Xinquan, YANG Chengmin1
       1. Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100094, China;
       2. Hainan Branch, Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Xinglong Town, Hainan Province 571533, China
       Abstract：ObjectiveTo establish and optimize the ISSR-PCR reaction system for Bupleurum chinense DC.; to screen the suitable primers and determine their optimal annealing temperatures. MethodsGenomic DNA was extracted by CTAB method from Bupleurum chinense DC. plant leaves. The main influencing elements in different levels were tested by single factor experiment. The gradient PCR was used to determine the optimal annealing temperatures of each selected primer.ResultsThe optimal reaction system for ISSR analysis contains 1× Taq DNA polymerase reaction buffer, 20 ng template DNA, 1.5 U Taq DNA polymerase, 2.0 mmol/L MgCl2, 0.15 mmol/L each of dNTPs, 0.3 μmol/L primer, 2% formamide deionized in 25 μl total reaction volume. 30 primers which showed clearer and more bands from 100 primers were selected and the optimal annealing  temperatures were 49.9～63.6℃ (changed among different primers). ConclusionThe stable and reproducible optimal ISSR-PCR reaction system and suitable annealing temperatures of 30 selected primers from 100 are established for Bupleurum chinense DC. which had laid the good foundation for ISSR analysis on studies of germplasm resources identification, molecular marker assisted breeding and genetic diversity.
       Key words：Bupleurum chinense DC.;   Genomic DNA extraction;   ISSR-PCR
       柴胡为伞形科(Umbelliferae)柴胡属Bupleurum L.植物。属内植物种类很多，全世界约有150种，是伞形科中的一个大属。据中国植物志记载我国共有柴胡属植物36种，17变种，7变型［1］。包括柴胡属在内的伞形科植物的分类鉴定一直是植物分类研究的热点之一。分子生物学技术的应用能够为植物分类与进化研究提供更多分子方面的证据。目前已有利用脂酶同工酶谱带［2］、ITS序列分析［3，4］及RAPD方法［5］针对柴胡属内不同种进行了鉴定研究。另外，柴胡的野生资源已日渐减少，各地正积极推进北柴胡的家种生产，栽培新品种的选育势在必行。分子标记技术是现代分子育种过程必不可少的技术之一，可以用于育种材料的选择，也可以在杂种后代早期选择鉴定中加以利用，以减少育种盲目性，加速育种进程。
       ISSR(Inter-Simple Sequence Repeat)分子标记技术又称为简单序列重复区间扩增，由加拿大蒙特利尔大学的Zietkiewicz等在1994年提出的。ISSR标记技术具有实验操作简单、快速和高效，遗传多态性高，重复性好，且无需知道基因组序列信息以及耗资少等特点，在植物分类与进化，遗传多样性分析以及遗传图谱构建和基因定位等方面均有广泛的应用［6～9］。但目前还没有关于柴胡ISSR分析研究的报道，将ISSR分子标记技术引入柴胡的分类、种质资源鉴定和遗传图谱构建等研究中，能够促进柴胡分类研究及育种实践方面的进展。
       1  材料
       北柴胡叶片取自中国医学科学院药用植物研究所实验地。ISSR引物（100条）参照加拿大哥伦比亚大学（UBC）提供的序列由上海生工合成；DNA提取所用试剂购自北京拜尔迪生物技术公司，其它PCR所需试剂购自上海生工。PCR反应在Eppendorf的Mastercycler梯度PCR仪上进行。
       2  方法
       2.1  叶片总DNA提取与检测取0.2 g新鲜样品在液氮中研磨至粉末状，转入1.5 ml 离心管，加入600μl 65℃预热的2% CTAB提取缓冲液［2% CTAB；100 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0; 1.4 mol NaCl; 20 mmol/L EDTA; 0.2% (V/V) β-巯基乙醇（现用现加）］，65℃水浴30 min，其间摇动3～4次。然后用酚仿抽提两次。上清液中加入等体积-20℃预冷的异丙醇，-20℃沉淀DNA。70%乙醇洗涤沉淀后干燥。含RNA酶的TE酶解RNA。适当扩大体积后再用酚仿抽提一次，吸取上清液。加入1/10体积NaAc，二倍体积无水乙醇沉淀DNA，洗涤、干燥后加入50～100 μl TE溶解，-20℃保存备用。
       
       利用TECHCOMP UV1102紫外分光光度计测定A260/A280的紫外吸收比值，以衡量DNA的纯度。提取的DNA溶液稀释3个浓度梯度（5倍, 10倍和20倍），标准λ-DNA稀释5个浓度梯度（每4μl分别含有150，100，80，60 ng和40 ng λ-DNA），在8%（M/V） 琼脂糖凝胶中电泳后成像。利用Bio-Rad凝胶定量软件Quantity One定量分析DNA浓度。TE缓冲液将其稀释为20ng/μl，-20℃保存备用。
       2.2  单因子实验确定ISSR-PCR的最佳反应体系　以叶片基因组DNA为模板，根据报道的实验方法［7，10］，初步确定PCR反应体系为25μl总体积中含有1× Taq 酶缓冲液(50 mmol/L KCl, 10mM Tris-HCl, pH9.0, 0.1% Trion X-100)，1.5mmol/L MgCl2，各0.2mmol/L的dNTPs，0.4μmol/L引物，1.0 U Taq酶，40 ng 模板DNA和2%去离子甲酰胺，按照理论Tm值确定退火温度，即引物合成时由合成仪自动打印出的Tm值，首先从10条引物中选择扩增条带数较多的引物之一即ISSR引物809作为后续PCR扩增体系优化的引物，对影响扩增的主要参数设置了不同梯度处理。反应总体系为25μl，其中DNA模板设5，10，20，40 ng 4个浓度梯度；引物浓度设0.05，0.1，0.2，0.3，0.4，0.6 μm 6个梯度；dNTPs设置0.05，0.1，0.15，0.2，0.25 mmol/L 5个浓度梯度；Mg2+浓度设1，1.5，2.0，2.5，3.0 mmol/L 5个梯度；Taq DNA聚合酶设0.5，1，1.5，2 U 4个梯度。另外根据Tm值对退火温度设置了49.9，51.3，52.8，54.5，56.1，57.7，59.9℃ 7个梯度。每一个合适的条件确定后将其作为后续研究的一个条件。反应程序为94℃预变性7 min；然后45个循环：每个循环94℃变性45 s，49.9～63.6℃（因引物不同而异）退火90 s，72℃延伸2 min；循环结束后72℃延伸7 min。ISSR-PCR产物采用1.6%（M/V）琼脂糖凝胶电泳分离，紫外自动凝胶成像系统上观察并拍照记录。
       2.3  ISSR引物筛选及其最佳退火温度的确定  首先根据单因子实验确定的柴胡ISSR-PCR的最佳反应体系，以每条引物的理论退火温度设定反应程序，从100条ISSR引物中筛选出能够扩出清晰条带的44条引物。再针对筛选出的引物在Tm±3℃～Tm±5℃范围内设定6个温度梯度逐个进行梯度退火实验。
       3  结果
       3.1  叶片基因组DNA的提取 
       本实验提取的DNA为无色沉淀，电泳显示DNA完整，无明显降解现象(见图1)。用紫外分光光度计测定DNA在260 nm和280 nm的光吸收比值(A260/A280)为1.73～1.85。定量分析表明浓度在100～200 ng/μl之间。
       3.2  退火温度对ISSR-PCR扩增的影响 
       ISSR-PCR扩增过程中，不同退火温度的设定能明显地影响扩增产物的带型。本实验首先以引物809为例，进行退火温度梯度试验，确定了引物809以柴胡基因组DNA为模板扩增的最佳退火温度为54.5℃（见图2a），然后在这一条件下，研究PCR反应中其他因素的影响，从中选择确定最优的反应条件。
       3.3  Taq DNA聚合酶用量对ISSR-PCR扩增的影响 
       Taq DNA聚合酶的用量及其厂家是影响PCR扩增结果的一个重要因素。本实验在25μl ISSR-PCR反应体系中对Taq DNA聚合酶设置了0.5，1.0，1.5和2.0 U共4个梯度，结果如图2b所示，体系中加入0.5 U和1.0 U Taq DNA聚合酶时扩增条带不明显，2.0U扩增的条带较1.5U扩增的条带稍弱。因此，在本实验条件下，25μl反应体系中加入1.5 U Taq DNA聚合酶为最佳。
       3.4  dNTPs浓度对ISSR-PCR扩增的影响  dNTPs的用量影响
       到碱基掺入的正确与否以及扩增产率的高低。本实验设置了5个浓度梯度，从图2c可以看出，dNTPs浓度过高和过低都导致分子量相对较大的条带得不到有效扩增，0.15 mmol/L为反应最优水平。
       3.5  引物浓度对ISSR-PCR扩增的影响 
       从图2d中可以看出在较低引物浓度下，分子量相对较小的条带较弱，较高的引物浓度下分子量相对较大的条带较弱。当浓度为0.3 μmol/L时，反应稳定，条带清晰。因此选择0.3 μmol/L作为柴胡ISSR-PCR反应体系中最佳的引物浓度。
       3.6  Mg2+浓度对ISSR-PCR扩增的影响 
       本实验设置了5个Mg2+浓度梯度，从中筛选出最适于柴胡ISSR-PCR扩增的Mg2+浓度。从图2 e中可以看出Mg2+浓度为2.0 mmol/L时，PCR扩增结果最佳。浓度较低时条带不清晰，且条带数目下降；浓度较高时，条带数目少而且背景水平高。
       3.7  模板DNA用量对ISSR-PCR扩增的影响
        
       DNA模板的质量和用量是影响ISSR-PCR扩增效果的一个重要因素。本实验设置了4个模板DNA用量梯度，结果如图2f所示，模板DNA为5ng时，扩增条带很少，且非常弱，10 ng时，扩增条带弱，背景较高，而DNA用量为20 ng和40 ng时，扩增结果基本一致，因此本实验选择20 ng为反应体系中模板DNA的用量。
       3.8  引物筛选及最佳退火温度的确定 
       通过对初步筛选出的44条引物进行的梯度退火实验，从中选择出了扩增条带清晰且条带数超过8条的30条引物，并确定了引物的最佳退火温度（见表1）。图3为其中的两个引物：引物845和847（理论退火温度均为55.02℃）的梯度退火PCR，从图3中可以看出，引物845扩增条带受温度的影响较大，在退火温度为53.7℃时，ISSR-PCR产物较更低的温度52.6℃时增加了1条带，其它个别条带也更清晰，在退火温度为55.0℃时，扩增条带数减少了3条，其它个别条带也变弱，因此确定最佳退火温度为53.7℃。引物847扩增条带受温度的影响不大，确定其最佳退火温度为55.0℃。从中可以看出ISSR分析过程中首先确定不同引物的最佳退火温度是必要的。表1  适合柴胡ISSR分析的引物序列及其最佳退火温度（略）
       4  讨论
       目前已发展起来的DNA分子标记技术包括RFLP，RAPD， AFLP，SSR，ISSR，SNP及EST等，在药用植物研究中应用较多的是RAPD和ITS序列分析，也有应用蛋白质和同工酶的研究报道［2］。蛋白质电泳图谱主要是通过肉眼观察比较，人为区分，在一定程度上影响了结果的准确性。同工酶研究在取样时必须是新陈代谢活跃的部位，操作过程需保证酶活性，而且目前仅有二十多种同工酶表现出位点多态性，限制了其应用。RAPD分子标记技术也由于稳定性差在很大程度上限制了其发展。ITS序列分析在被子植物近缘属间及种间关系的研究中具有重要意义，但通常不适用于种内个体间遗传多样性研究。而相比其它分子标记技术，ISSR方法具备RAPD的简便及易操作性，而其可靠性和可重复性更高，每个引物产生的多态性也更高。本文对柴胡的ISSR-PCR反应体系进行了优化，筛选出了合适的引物，并确定了每种引物的最佳退火温度，为ISSR在柴胡的分类鉴定和育种学研究中的应用奠定了基础，也为柴胡属以外的其它伞形科植物的分类与进化研究提供借鉴。
       【参考文献】
         　　［1］中国植物志编委会. 中国植物志［M］.北京：科学出版社, 1999：215.
       
       ［2］丁锐, 李利华. 利用脂酶鉴定柴胡及其亲缘关系的研究［J］.安徽农业科学, 2006, 34 (13)：2983.
       
       ［3］武莹, 刘春生, 刘玉法, 等. 5种习用柴胡的ITS序列鉴别［J］.中国中药杂志, 2005, 30 (10）：732.
       
       ［4］Neves S S, Watson M F. Phylogenetic relationships in Bupleurum (Apiaceae) based on nuclear ribosomal DNA ITS sequence data［J］.Ann Bot, 2004, 93：379.
       
       ［5］梁之桃, 秦民坚, 王峥涛, 等. 柴胡属5种植物RAPD分析与分类鉴定［J］.中草药, 2002, 33 (12)：1117.
       
       ［6］周延清. DNA分子标记技术在植物研究中的应用［M］.北京：化学工业出版社, 2005：143.
       
       ［7］Pharmawati M, Yan G, Finnegan P M. Molecular Variation and Fingerprinting of Leucadendron Cultivars (Proteaceae) by ISSR Markers［J］.Ann Bot, 2005, 95: 1163.
       
       ［8］Cekic C, Battey N H, Wilkinson M J. The potential of ISSR-PCR primer-pair combinations for genetic linkage analysis using the seasonal flowering locus in Fragaria as a model［J］.Theor Appl Genet, 2001, 103: 540.
       
       ［9］黄福平，梁月荣，陆建良，等. 应用RAPD和ISSR分子标记构建茶树回交1代部分遗传图谱［J］.茶叶科学, 2006, 26 (3): 171.
       
       ［10］周延清，景建洲，李振勇，等. 怀地黄ISSR扩增条件优化的研究［J］. 西北植物学报, 2004, 24 (1): 6.