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       【摘要】 
       目的确定柴胡有效成分提取的最佳工艺。方法以柴胡中挥发油吸收度和柴胡皂苷a的含量为指标，采用单因素实验筛选主要因素和水平，再以正交实验筛选柴胡有效成分提取最佳工艺。结果最佳工艺参数为40℃温浸，收集相当于药材2倍量蒸馏液，继用8倍量含5%氨水的95%乙醇回流1 h提取柴胡皂苷，可使挥发油吸收度达0.941，柴胡皂苷a的含量达0.32%。结论该工艺为柴胡有效成分的提取提供了可靠依据，且工艺条件稳定可靠，重复性好。
       【关键词】  提取工艺 柴胡皂苷a 挥发油 正交实验
       Study on Extraction Technology of Active Ingredients from Bupleurum chinense DC
       XIAO Gong-sheng，YANG Yun*，SUN Wei-ying,FENG Yun-xia，ZHU Zhen-hua 
       College of Pharmacology, Henan University of Traditional Chinese Medicine, Zhengzhou 450008, China
       Abstract：ObjectiveTo determine the optimum technology of active ingredients from Bupleurum chinense DC.MethodsWith the absorbance of volatile oils and the content of saikosaponin a in Bupleurum chinense DC as indexes, the major influencing factors and levels were observed by single factor experiment, and the optimum technology was optimized by orthogonal experiment. ResultsThe optimum condition was as follows: the impregnating temperature was 40℃ ,the volume of distilled fluid was 2 times of weight of Bupleurum chinense DC, and the volume of 95%alcohol with 5%ammonia water to reflux extraction for 1hour was 8 times of weight of Bupleurum chinense DC, then the absorbance of volatile oils was 0.941 and the content of saikosaponin a was 0.32%.ConclusionThe optimum technology provides reliable evidence for extraction of active ingredients from Bupuleurum chinense DC, and the conditions are accurate and reliable with good reproducibility.
       Key words：Extraction technology;   Saikosaponin a;   Volatile oils;   Orthogonal experiment
       
       柴胡为伞形科植物柴胡Bupleurum chinense DC.或狭叶柴胡Bupleurum scorzonerifolium Wild的干燥根［1］。具有疏散退热、疏肝解郁、升阳举陷之功效，为中医治疗少阳症的首选要药。其主要化学成分为柴胡皂苷和挥发油类。柴胡作为临床常用药，中成药制剂品种众多，且大多以煎煮法提取柴胡皂苷类成分，而多以水蒸气蒸馏法提取挥发油［2］。由于柴胡皂苷a、d化学结构均具不稳定性，遇酸或受热易分别降解生成活性较弱的次生苷b1，b2，因此随着水蒸气蒸馏法提取时间的延长，柴胡皂苷a，d的含量将逐渐降低，以致严重影响了柴胡制剂的质量和临床疗效。目前国内关于柴胡提取工艺的文献报道较多，但多以挥发油或柴胡皂苷a单独为指标进行考察，很少有同时考察挥发油和柴胡皂苷a的文献报道，更是未曾有文献报道过在保证挥发油提取率的同时还兼顾柴胡皂苷a的充分提取。因此，本研究采用正交实验综合考察柴胡中挥发油吸收度和柴胡皂苷a含量，筛选最佳工艺，以期为提高柴胡制剂的质量和疗效打下坚实基础。
       1  仪器与试药
       1.1  仪器
       岛津LC-20A高效液相分析仪（SPD-20A紫外检测器）；752紫外分光光度计（上海精密仪器科技有限公司）；RE 52-86A 旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；METTLER AE240电子分析天平（瑞士）。
       1.2 试药柴胡药材购于河南省药材公司，经本院陈随清教授鉴定为伞形科植物柴胡 Bupleurum chinense DC.的干燥根；柴胡皂苷a对照品自制，经峰面积归一化法测定含量为：99.91% ；乙腈为色谱纯；水为双重蒸馏水；其他试剂均为分析纯。
       2  方法
       2.1  单因素实验
       分别以药材浸渍温度、浸渍时间、料液体积比、蒸馏液收集量等为因素，在不同水平下进行单因素实验，筛选出影响柴胡挥发油提取的主要因素和水平，同样分别以乙醇浓度、pH值、柴胡皂苷提取时间、料液体积比等为因素，在不同水平下进行单因素实验，筛选出影响柴胡皂苷提取的主要因素和水平。从而为正交实验设计提供依据。
       2.2 挥发油的提取和测定方法随机称取50 g柴胡干燥粗粉，置于500 ml圆底烧瓶中，采用水蒸气蒸馏法在不同条件下提取柴胡挥发油，收集蒸馏液，加3%丙二醇摇匀，精密量取上述蒸馏液2 ml两份，一份置5 ml容量瓶中，加蒸馏水定容，摇匀，作为样品液，另一份置蒸发皿中，置水浴上蒸干，残渣用蒸馏水溶解，转移至5 ml容量瓶中，加蒸馏水定容，摇匀，作为空白。用752紫外分光光度计在277 nm波长处测定蒸馏液中挥发油的吸收度。
       2.3  柴胡皂苷的提取取提取挥发油后的药渣，滤干，置于500 ml圆底烧瓶中，在不同条件下回流提取柴胡皂苷，过滤得滤液，减压低温浓缩成每毫升含0.5 g柴胡的浓缩液，备用。
       2.4  柴胡皂苷a 含量测定
       2.4.1  色谱条件大连伊利特C18(4.6 mm×250 mm,5μm)；流动相为乙腈-水37∶63；流速1 ml/min；检测波长208 nm；柱温35℃；进样量20 μl。
       2.4.2  对照品溶液的制备精密称取柴胡皂苷a对照品5.09 mg，加甲醇溶解并定容至10 ml，摇匀，配成0.509 mg/ml对照品溶液，冷藏备用。
       2.4.3  供试品溶液的制备取上述浓缩液10 ml减压蒸干，加20 ml甲醇溶解残渣，过滤得滤液。再取2 ml滤液至10 ml容量瓶中，加甲醇定容，摇匀，冷藏备用。
       2.4.4  线性范围考察精密吸取对照品储备液2.0，6.0，10.0，14.0，18.0 μl，在“2.4.1”项下色谱条件下进样测定，记录峰面积，以峰面积积分值Y为纵坐标，对照品溶液进样量X（μl）为横坐标，进行线性回归（n=5）， 得线性回归方程为Y=209 413.7X－162 379.4，线性范围为0.972 0～9.635μg，相关系数为r=0.999 7，线性关系良好。
       2.4.5   精密度实验
       精密吸取对照品20 μl，在“2.4.1”项下色谱条件下重复进样5次测定，记录峰面积，RSD为1.5%（n=5），表明精密度良好。
       2.4.6   稳定性实验
       将供试品溶液在室温下贮存，在“2.4.1”项下色谱条件下，分别于0，2，4，6，8h进样测定，记录峰面积，RSD为2.0%，表明样品在8 h内稳定。
       2.4.7  重复性实验 
       精密称取同一批样品5份，按供试品溶液处理方法制备样品溶液，在“2.4.1”项下色谱条件下重复进样测定5次，记录峰面积，RSD为2.1%（n=5）。
       2.4.8  样品测定精密吸取20 μl样品溶液，在“2.4.1”项下色谱条件下进样测定，记录峰面积，计算各样品中柴胡皂苷a的含量。
       2.5  正交实验以柴胡蒸馏液中挥发油的吸收度和柴胡皂苷a的含量为检测指标，参照单因素实验结果，分别以药材浸渍温度、挥发油收集量、柴胡皂苷提取时间、柴胡皂苷提取溶剂料液比等主要因素及不同水平进行L9(34)正交设计，筛选最佳工艺。正交实验因素和水平见表1。表1  正交实验因素及水平（略）
       3  结果
       3.1   浸渍温度对挥发油提取效果的影响分别在30，40，60，80℃温度下浸渍6 h，料液比1∶6，提取1次，考察浸渍温度对挥发油提取效果的影响。测得吸收度依次为：0.303，0.984，0.758，0.587。由测定结果可知，在40℃下浸渍吸收度达到最大。且变化显著，所以浸渍温度应选在40℃左右。
       3.2  浸渍时间对挥发油提取效果的影响在40℃下，分别浸渍0，2，4，6，8 h，料液比1∶6，提取1次，考察浸渍时间对挥发油提取效果的影响。测得吸收度依次为：0.470，0.559，0.650，0.940，0.722。由测定结果可知，浸渍6h吸收度最大，浸渍4h和8h吸收度相当。
       3.3  料液比对挥发油提取效果的影响料液比分别为1∶5，1∶6，1∶8，1∶10，提取1次，考察料液比对挥发油提取效果的影响，测得吸收度依次为：0.316，0.443，0.337，0.258。由测定结果可见，料液比1∶6吸收度最大。且变化显著。
       3.4  挥发油收集量对挥发油提取效果的影响分别收集100，200，300 ml蒸馏液，考察挥发油收集量对挥发油提取效果的影响，测得吸收度依次为：0.454，0.507，0.596。由测定结果可知。随着收集量的增多，吸收度逐渐增大，但增加趋势不显著。
       3.5  乙醇浓度对柴胡皂苷提取效果的影响分别以95%，75%，60%，45%乙醇，料液比为：1∶6，提取柴胡皂苷。考察不同乙醇浓度对柴胡皂苷提取效果的影响，柴胡皂苷a含量依次为：0.20%，0.15%，0.12%，0.12%。由测定结果可知，柴胡皂苷提取率随乙醇浓度的降低而降低。在95 %乙醇浓度时最大。且变化较显著。因此选用95 %乙醇提取。
       3.6  pH值对柴胡皂苷提取效果的影响分别用0，5%，10%，15%的氨水95%乙醇液提取皂苷。考察pH值对柴胡皂苷提取效果的影响，柴胡皂苷a含量依次为：0.20%，0.25%，0.24%，0.24%。由测定结果可知，碱性乙醇提取效果比较好，含5%～10%氨水95%乙醇条件下提取液中柴胡皂苷a变化不显著，因此选用含5%氨水。
       3.7  提取时间对柴胡皂苷提取效果的影响用95 %乙醇分别在0.5，1，2，3h提取皂苷。考察提取时间对皂苷提取效果的影响。柴胡皂苷a含量依次为：0.20%，0.25%，0.20%，0.20%。由测定结果可知，提取1h时提取率最大。提取时间再长提取率就逐渐下降。
       3.8  料液比对柴胡皂苷提取效果的影响在10，8，6，5，3倍不同料液比条件下回流提取柴胡皂苷。考察料液比对柴胡皂苷提取效果的影响。柴胡皂苷a含量依次为：0.15%，0.15%，0.20%，0.21%，0.14%。由测定结果可知，料液比为在5～6倍时提取率最大。
       3.9  正交实验结果与分析因柴胡中的挥发油和柴胡皂苷a均为有效成分，权重应相等。则规定吸收度中最大值0.945及柴胡皂苷a含量中最大值0.33%为100，其余值对应比较，两项加和后平均得综合评分值。结果见表2，方差分析见表3。表2  正交实验结果与分析（略）表3  误差分析（略）
       由表2和表3可知，柴胡挥发油收集量的极差最大，其次是料液比和柴胡皂苷提取时间，故对于柴胡提取效果影响的大小顺序为B>D>C>A，由于A和C影响不显著，故综合考虑，选择最佳提取方案为A1B1C1D3，即40℃浸渍，收集100 ml挥发油，8倍量含5 % 氨水的95 %乙醇提取1 h。
       3.10  最佳方案的验证实验取50g柴胡粗粉置500ml圆底烧瓶中，在最佳提取条件下提取。重复两次。结果见表4。表4  验证实验结果（略）
       由表4可见，采用优化最佳工艺提取有效成分柴胡挥发油和皂苷，其挥发油吸收度和柴胡皂苷a的含量都较高，且工艺条件稳定可靠，重复性好。
       4 讨论
         
       柴胡挥发油和柴胡皂苷为柴胡的主要有效成分，两者的提取是较为矛盾的。据文献资料，柴胡皂苷在6 h内稳定，而要完全提取挥发油则要较长时间。这将导致柴胡皂苷的分解、降解等一系列不稳定的反应，使柴胡皂苷的含量降低。因此要同时兼顾挥发油和柴胡皂苷的提取，可考虑采用水蒸气蒸馏法提取柴胡挥发油，采用碱性醇提工艺代替传统的水提工艺提取柴胡皂苷。且在提取过程中发现，柴胡皂苷a受热容易分解，随着加热时间增长，含量逐渐减少，因此在各加热环节，如提取，浓缩，干燥过程中应尽量采用低温，以减少柴胡皂苷a的损失。
         
       中药成分复杂,应综合考虑各有效成分的性质及其在制备过程中的变化,以保证制剂的质量和疗效。据文献资料，柴胡中含柴胡皂苷a大约在0.2 %～0.4 %，从本实验最佳工艺提取液中测得柴胡中柴胡皂苷a的含量为0.32 %，因此本工艺提取效果较好。至于挥发油的含量，各种文献所得结果不尽相同，甚至相差10倍以上，由于药材的原因，如药材部位、采收时间、产地等的影响难以衡量，因此本实验在不影响挥发油提取的前提下还兼顾了柴胡皂苷a的提取，从而为柴胡的提取提供可靠的依据和参照。
       【参考文献】
         　　［1］国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］.北京:化学工业出版社，2005：562.
       
       ［2］杨云.天然药物化学成分提取分离手册（修订版）［M］.北京:中国中医药出版社,2002:612.